血浆高分子量激肽原在宿主防御细菌感染中的作用及机制的初步研究

摘要

【研究背景和意义】
　　血浆高分子量激肽原（High molecular weight kininogen，HK）是血浆激肽释放酶-激肽系统（Plasma kallikrein-kinin system，KKS）的关键蛋白。已有体外研究表明，HK的第三个结构域和第五个结构域的片段均具有抗菌作用。但是，对于HK在体内的作用仍然是未知的。本研究使用HK蛋白缺陷的Kng1-/-小鼠，研究HK在宿主防御细菌感染中的作用并初步探究其作用机制。
　　【研究目的】
　　认识HK蛋白在宿主防御细菌感染中的作用并初步探究其作用机制。
　　【研究方法】
　　建立大肠杆菌（Escherichia coli，E.coli）腹腔注射模型和盲肠结扎穿孔（Cecal ligation and puncture，CLP）模型，观察Kng1-/-小鼠和其同窝对照Kng1+/+小鼠的生存率，并绘制生存曲线。通过H&E染色观察和评价盲肠结扎穿孔模型中肺脏和肝脏的病理变化；应用血平板计数检测腹腔灌洗液、血液及脾脏和肝脏组织中细菌的数目；应用实时定量 PCR检测白细胞中炎症因子 mRNA的表达水平；利用Western blotting方法检测 HK与细菌的结合及 HK的裂解；利用 Kng1+/+小鼠和Kng1-/-小鼠血浆检测HK蛋白的杀菌效率；利用PK抑制剂DX-2930和FXII抑制剂CTI对血浆蛋白活性的干预，检测大肠杆菌导致HK的裂解及HK的杀菌效率是否依赖于KKS的活化。
　　【研究结果】
　　（1）Kng1基因敲除小鼠肝脏中没有Kng1 mRNA的表达，并且血浆中检测不到HK蛋白，证实Kng1基因敲除小鼠模型建立成功。（2）在细菌感染模型中，与Kng1+/+小鼠相比，Kng1-/-小鼠的生存率明显降低（大肠杆菌腹腔注射模型中小鼠的生存率：67.5％vs.11.111%，p=0.0017；盲肠结扎穿孔模型中小鼠的生存率：75%vs.11.667%，p=0.0434；Kng1+/+vs. Kng1-/-），提示血浆HK在宿主防御细菌感染中具有保护作用；（3）H&E染色结果显示，盲肠结扎穿孔模型中，Kng1+/+小鼠肺组织中有少量炎性细胞浸润，肺间质增生较弱，肝脏有轻微气球样变性，提示细菌感染可以导致肺脏及肝脏病理损伤。而Kng1-/-小鼠上述肺脏和肝脏病理表现明显加重，肺组织中可见大量炎性细胞浸润，肺间质增生明显，肝脏发生明显气球样变性。上述观察提示在细菌感染中，HK的缺陷可以加剧肺和肝脏组织损伤；（4）在大肠杆菌（108 colony-forming unit（CFU），200l）腹腔注射后18小时，Kng1+/+小鼠腹腔灌洗液、血液、肝脏和脾脏中可以检测到少量细菌的存在，提示细菌感染模型成功构建。Kng1-/-小鼠上述组分中细菌的数目明显增多（腹腔灌洗液：235000±59690 vs.944400±156400 CFU，p=0.0002；血液：0.5000±0.1581 vs.3.938±1.142 CFU，p=0.0056；肝脏：90630±32260 vs.845600±156200 CFU，p<0.0001；脾脏：338100±71100 vs.1033000±154700 CFU，p=0.0003；Kng1+/+ vs. Kng1-/-），提示在细菌感染中，HK的缺陷抑制体内细菌的清除。（5）应用实时定量 PCR发现，在正常情况下，HK的缺陷对炎症因子的表达无影响。在大肠杆菌（108 CFU，200?l）腹腔注射6小时后，与Kng1+/+小鼠相比，Kng1-/-小鼠白细胞中炎症因子 TNF-α和 IL-6的mRNA水平显著升高（TNF-α：17.00±5.110 vs.83.20±9.640，p=0.0001；IL-6：70.61±38.39 vs.1374±348.4，p=0.0059；Kng1+/+vs. Kng1-/-）。以上结果提示，在细菌感染模型中，HK的缺陷可以上调白细胞中炎症因子mRNA水平的表达；（6）大肠杆菌和小鼠血浆共孵育后，结合Western blotting检测发现，大肠杆菌可以与血浆中 HK结合并且使 HK发生裂解。当 Kng1+/+和Kng1-/-小鼠血浆与细菌共孵育后，与 Kng1+/+血浆相比，Kng1-/-血浆中细菌的数目有明显增加（共孵育1小时：21110±4231 vs.47000±8825 CFU，p=0.0207；共孵育2小时：4020±613.9 vs.6910±122.7 CFU，p=0.0494；Kng1+/+vs. Kng1-/-），进一步运用纯品HK与细菌共孵育，HK不被裂解，且细菌的数目与阴性对照组相比没有统计学意义，提示，只有裂解后的HK具有抗菌作用。（7）大肠杆菌分别与含有PK抑制剂（DX-2930）和FXII抑制剂（CTI）的人的血浆共孵育后，含有抑制剂的血浆中HK不裂解。与正常血浆相比，抑制血浆中PK和FXII活性后导致细菌的清除率降低（共孵育10小时：39600±5913 vs.68600±7305 CFU，p=0.0128；共孵育20小时：22400±3473 vs.36800±4236 CFU，p=0.0302；正常血浆 vs.含抑制剂血浆）。以上结果提示HK的杀菌作用依赖于KKS的活化。
　　【结论】
　　本研究说明在宿主防御细菌感染中，血浆高分子量激肽原通过KKS的活化发生裂解释放抗菌片段，从而发挥保护作用。

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引言

材料和方法

1. 实验材料

2. 实验方法

实验结果

1. Kng1-/-小鼠模型的建立和鉴定

2. 细菌感染模型中，HK缺陷促进小鼠死亡

3. 盲肠结扎穿孔模型中，HK的缺陷促进肺和肝组织损伤

4. 细菌感染模型中，HK的缺陷降低小鼠体内细菌的清除

5. 细菌感染模型中，HK的缺陷上调白细胞中炎症因子mRNA水平

6. 血浆HK能与大肠杆菌结合并裂解

7. 血浆HK的裂解能促进大肠杆菌清除

8. 血浆HK的裂解的杀菌作用依赖于KKS的活化

讨论

结论

参考文献

综述: 血浆激肽释放酶-激肽系统在脓毒症发病中的作用及研究现状

攻读学位期间发表的论文

英文缩略词

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