犬颈动脉分叉部动脉瘤发生模型的建立及其形态学、血流动力学和组织病理学研究

摘要

第一部分颈动脉分叉部动脉瘤模型的建立
　　目的：探讨血流动力增加联合弹力蛋白酶消化血管壁内弹力板和中膜结构，建立犬动脉分叉顶端实验性动脉瘤的可行性。
　　方法：（1）通过在体试验测试不同浓度弹力蛋白酶、在不同孵化时间下对血管壁结构破坏程度，选择构建颈动脉弹力板和中膜破坏最佳弹力蛋白酶浓度和孵化时间；（2）实验犬18只，手术重建犬颈总动脉构建Y-型动脉分叉，9只Y-型分叉分叉顶端采用弹力蛋白酶孵化，9只Y-型分叉顶端给予生理盐水假处理。术后1周、4周、3月行TCD和多普勒以及颈动脉血管造影观察Y-型分叉顶端是否伴有动脉瘤形成或动脉瘤样结构早期变化。术后3月获取Y-型分叉顶端组织学标本行病理学检查。
　　结果:(1)浓度为3.0 U/μl的弹力蛋白酶溶液持续孵化颈总动脉血管壁能够有效破坏内弹力板和中膜。(2)实验组和对照组Y-型分叉近端供养动脉血流速度术前、术后无明显差异，术后1周、3月所有实验动物Y-型分叉近端供养动脉血流速度均较术前明显增加。9只经弹力蛋白酶处理的Y-型分叉顶端实验动脉，随访血管造影和组织学观察5只可见顶端囊状动脉瘤形成，形态为宽基底型，瘤体平均直径3.2±0.4 mm，瘤颈6.7±2.3 mm；未经弹力蛋白酶处理的Y-型分叉顶端实验动脉，随访血管造影均未见囊状动脉瘤形成。组织学观察显示实验组和对照组分叉顶端均可见新生内膜垫形成，实验组邻近新生内膜垫附近可见典型动脉瘤病理结构，而对照组邻近新生内膜垫附近可见动脉瘤样血管壁重塑。
　　结论：血流动力增加联合弹力蛋白酶消化血管壁内弹力板和中膜结构能诱导犬动脉分叉顶端实验性动脉瘤。该犬模型可以用来进一步研究血流动力学、基因、蛋白或生理通道等对动脉瘤发生、发展、破裂的作用。
　　第二部分颈动脉分叉部动脉瘤模型的组织病理学研究
　　目的：在犬分叉部血管动物模型建立的基础上，研究动脉壁退化、炎症和细胞免疫反应是否会导致动脉瘤的发生、发展。
　　方法：建立18只犬颈总动脉（CCA）新的动脉分叉模型，随机分组为弹力蛋白酶处理动脉组（EBG，n=9）和分叉模型对照组（CBG,n=9）。同时用弹力蛋白酶处理直段 CCA作为直段对照组（ESG,n=3）。分别在术后12周（n=6）和24周(n=3)取EBG和CBG重建血管分叉的样本，ESG（n=3）在术后24周取双侧颈动脉直血管样本。术后获得的CCA样本行HE染色、Masson染色和弹力纤维染色。连续切片来评估重建血管分叉部组织学改变用Envision技术以抗小鼠增殖细胞核抗原（PCNA）抗体、小鼠α单克隆平滑肌肌动蛋白抗体、小鼠抗巨噬细胞单克隆抗体(MAC387)、MMP-2和MMP-9单克隆抗体为CCA样本行免疫标记。采用抗CD45的白细胞抗体和抗 MAC387的抗巨噬细胞抗体行免疫双荧光染色，判断白细胞中是包含否有巨噬细胞。测量平滑肌细胞增殖率（PCNA阳性平滑肌细胞所占比例）、弹力层和肌动蛋白阳性平滑肌层厚。炎症细胞浸润指数为CD45阳性细胞在血管分叉中膜有核细胞所占百分比。MMP-2和MMP-9表达水平定义为MMP-2/9阳性区域在血管分叉中膜中所占的面积百分比。组织病理学图像的统计分析软件为Image-Pro Plus Version6.0版(Media Cybernetics, Inc., Bethesda, MD, USA)，每个切片的中至少随机选择20个以上的高倍镜视野（×400倍）进行分析。
　　用软件GraphPad Prism5.0(San Diego, CA, USA)进行统计分析。连续变量用平均值±标准差表示，数值变量以数量或百分比表示。用确切概率法(Fisher’s检验)来比较分类资料。组间t检验来比较平滑肌细胞增殖率、弹力层和肌动蛋白阳性平滑肌层厚、炎症细胞浸润程度、MMP-2和MMP-9表达水平。所有数据均经双侧检验，P<0.05为差异有统计学意义。
　　结果:在形成动脉瘤的5个血管分叉样本中，活体组织观察发现整个血管壁变薄，成为半透明状态，并能观察到内部血流，从而容易导致变薄的血管壁膨出，分叉部动脉瘤形成。
　　HE染色、Masson染色显示ESG和EBG分叉部中膜变薄，平滑肌细胞减少，纤维连接缺失。弹力纤维染色显示ESG和EBG中，内弹力板不连续，弹力纤维断裂；CBG中三只动物动脉分叉顶部出现内膜轻度损伤。弹力蛋白酶的作用降低了中膜弹力纤维层厚，在EBG为21.2±15.3μm，ESG为71.28±19.47μm，而 CBG中为119.4±29.9μm（P<0.001）。
　　免疫组化染色显示，EBS中弹力蛋白酶处理过的动脉分叉顶部血管壁SMA阳性的平滑肌细胞数量减少，PCNA阳性的平滑肌细胞数目比例明显增加，EBG中为42.0±15.7％（对比ESG中为7.3±3.8%,CBG中为8.0±6.3%;P<0.001），平滑肌层变薄，在EBG中为31.3±16.7μm(对比 ESG中136.5±25.5μm,CBG中133.9±26.1μm, P<0.001)。血管壁炎症细胞浸润程度EBG中为38.4±10.6%(对比 ESG中5.1±2.1%, CBG中2.9±2.4%;P<0.001)。巨噬细胞染色显示血管壁内有巨噬细胞浸润，分布和白细胞相似。动脉瘤壁MMP-2和MMP-9表达水平分别为21.0±8.7%(对比ESG中1.2±1.4%，CBG中0.8±1.2%;P<0.001)和13.6±5.6%(对比ESG中0.9±0.8%，CBG中0.4±0.6%;P<0.001)。
　　结论：经过24周随访，EBG中5/9成功诱发动脉瘤，均经血管造影及病理确认。组织学分析显示EBG内弹力板（IEL）不连续、弹力纤维断裂、肌层变薄、平滑肌细胞减少、炎性细胞浸润（巨噬细胞）以及MMP-2和 MMP-9表达增多（对比CBG和ESG，P<0.001）。根据我们的实验数据推测动脉瘤的发生、发展和血管壁结构退行性变相关，炎症免疫反应在动脉瘤形成、生长中发挥了至关重要的作用。
　　第三部分颈动脉分叉部动脉瘤模型的形态学、血流动力学研究
　　目的：在犬分叉部血管动物模型建立的基础上，研究特定血流动力学变化、形态学变化是否会导致动脉瘤的发生、发展。
　　方法：建立18只犬颈总动脉（CCA）新的动脉分叉模型，随机分组为弹力蛋白酶处理动脉组（EBG，n=9）和分叉模型对照组（CBG,n=9）。同时用弹力蛋白酶处理直段CCA作为直段对照组（ESG,n=3）。在术后即刻、术后12周、术后24周分别行血管造影和计算机流体动力学（CFD）分析，如果动脉瘤样囊泡形成，从3D-DSA图像上分别测量瘤颈和瘤体最大值、载瘤动脉直径和角度。用3D-DSA行旋转性血管造影(Syngo AXIOM-Artis, Siemens, Germany)对重建血管分叉部进行三维成像，并测血管分叉血流流速作为边界条件引入 CFD模拟软件(Mimics10.0; Materialise, Leuven, Belgium)，分析壁切应力（横向力WSS），流速场，流速曲线，表面相对压力场（纵向力）和总压力场。计算壁切应力梯度（WSSG），同时对EBG血管分叉模型的WSS和WSSG进行定量分析。
　　结果:血管分叉模型在所有动物均成功建立。血管造影显示EBG组9只犬模型中的5只可以在动脉分叉顶部观察到新生动脉瘤形成。但EBG随访24周后未观察到动脉瘤破裂，较12周随访时仅有轻度增大（3.5±0.3 mm对比3.0±0.2 mm;P=0.076）。载瘤动脉直径和成角分别为在CBG为4.3±0.4 mm和112.9±36.1°，在EBG为4.3±0.4 mm和120.3±44.2°。EBG中形成动脉瘤模型的5根载瘤动脉分叉角度为146.8±40.84°，而对照组为87.25±18.87°（P=0.032）。
　　CFD分析显示：由于对侧CCA的结扎，重建血管分叉中载瘤动脉内血流速度从85.3±7.5 cm/s增长至128.8±13.1 cm/s。术后CBG和EBG载瘤动脉壁WSS增高，血管分叉根部区域处于一个更为复杂的血流动力学环境中。血管分叉顶部 WSS减低、血流速度减慢，沿分叉顶部往两侧，WSS和血流速度都是先增大至最大值而后下降至和直段动脉相近。分叉顶部的相对压力和总压力最高，然后再向血管分支方向减低至正常值。血流动力学参数在术后和24周后在ESG、CBG和EBG中4/9没有出现形态学改变的模型中是相似的。EBG中5/9产生动脉瘤的血管的WSS和WSSG进行定量分析，分别在动脉分叉顶部同侧相距1、2、3mm处进行，显示术后24周发生明显下降(P≤0.01)，这导致囊状动脉瘤的形成。这些动物随访过程中相对压力和总压力也是降低的。对EBG术后WSS和WSSG的定量分析显示动脉瘤形成的模型较无动脉瘤形成的模型WSS（多在顶部2mm处）和WSSG（顶部0-2mm处）通常更高。
　　结论：本实验虽然对所有模型都进行了弹力纤维的损伤来模拟动脉壁退化，但只有在5/9模型中出现了新生动脉瘤。我们认为血管分叉角度是重要的影响因素，“T”型分叉（146.8±40.84°）比“Y”型分叉（87.25±18.87°）更易发生动脉瘤。分叉角度与血流速度和涡流强度紧密相关，角度越大，分叉顶部周围涡流强度越大，层流紊乱，从而产生各种机械刺激，如 WSS和 WSSG。本实验对血管分叉部 WSS和WSSG的定量分析证明较大血管分叉模型动脉瘤形成前，动脉分叉顶部周围WSS和WSSG较高。WSS或WSSG的增高损伤了正常血管内皮的功能，激发基因转录，激活离子通道，从而导致细胞骨架的重组。

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声明

中文摘要

英文摘要

目录

第一部分 血流动力学联合弹力蛋白酶消化诱导建立顶端动脉瘤模型

前言

一、材料和方法

二、结果

三、讨 论

四、小结

参考文献

第二部分 犬颈动脉分叉部动脉瘤模型的组织病理学研究

前言

一、材料和方法

二、结果

三、讨论

四、小结

参考文献

第三部分 颈动脉分叉部动脉瘤模型的形态学、血流动力学研究

前言

一、对象和方法

二、结果

三、讨论

四、小结

参考文献

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