苯乙醇胺A和沙丁胺醇单克隆抗体的制备及其酶联免疫吸附分析方法的建立

摘要

随着社会的进步和生活水平的提高，人们对食品安全越来越重视，尤其关注食品中存在的对人体健康产生不利影响的兽药残留。作为七大兽药残留中的一大类，β-受体激动剂因其显著的营养再分配作用，常被非法用在畜牧业生产中。肉制品中残留的β-受体激动剂通过食物链可在人体内累积，危害消费者的身体健康。由β-受体激动剂引发的各类中毒事件也是时有发生，造成了恶劣的社会影响。因此，急需建立方便快速的检测方法加强对这类β-受体激动剂的监管。本文希望通过制备高灵敏度、高特异性的苯乙醇胺 A和沙丁胺醇单克隆抗体，建立相应的酶联免疫吸附分析方法(ELISA)，用来有效的监测实际样品中的β-受体激动剂残留。
　　苯乙醇胺A（Phenylethanolamine A，PA）是近年来出现的一种新的β-受体激动剂，目前作为促生长剂被非法用于畜牧业中。本研究成功制备了针对苯乙醇胺 A的特异性单克隆抗体，在此基础上建立了高灵敏度、高特异性的用于检测动物组织样品中苯乙醇胺A的ELISA法。首先对苯乙醇胺A的分子结构进行修饰，使之成为带氨基的半抗原衍生物，再与载体蛋白即牛血清白蛋白（Bovine serum albumin, BSA）或卵清白蛋白（Ovalbumin, OVA）偶联，形成免疫原以及包被原。其中以PA-BSA偶联物为免疫原免疫小鼠，取免疫小鼠的脾细胞与小鼠的骨髄瘤细胞融合后获得了一株灵敏度较高的单克隆抗体细胞株。以单克隆抗体为基础建立了检测苯乙醇胺 A的间接竞争 ELISA法，并对方法的灵敏度，特异性，精确度以及准确性进行了表征。在最优条件下，基于同源性包被抗原/抗体测定苯乙醇胺 A的ELISA法的IC50为0.16 ng/mL，检出限（LOD）为0.011 ng/mL，比已有文献的灵敏度高1.3-17倍。与其它十四种β-受体激动剂的交叉反应低于0.59％，证明所建立的ELISA不仅灵敏度高，而且特异性强。选择猪肉以及猪肝作为实际样品进行样品加标回收实验，回收率在91.40-105.51%，批内变异系数(Coefficients of variation, CV)为1.56–9.92%(n=3)，批间CV为2.02-11.71%(n=3)。用高效液相色谱串联质谱（LC–MS/MS）对ELISA进行验证，发现两种方法结果的相关系数为0.98，相关性良好。本文所建立的ELISA法具有灵敏度高、特异性强、简便、准确可靠的特点，可用于实际样品中苯乙醇胺 A的检测。
　　沙丁胺醇是继克伦特罗之后另一种被普遍滥用的β-受体激动剂。本研究通过丁二酸酐法合成沙丁胺醇衍生物，使之带有活性基团羧基，再与载体蛋白偶联，制成免疫原和包被原。对免疫小鼠抗血清进行效价测定，发现血清滴度能达到104以上，基于抗血清建立的ELISA法的IC50为6.91 ng/mL，LOD值为0.19 ng/mL。希望在此良好的基础上，后期能获得稳定分泌特异性单克隆抗体的细胞株。

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第一章 绪论

1.1 β-激动剂概述

1.2免疫分析法概述

参考文献

第二章 苯乙醇胺A单克隆抗体的制备

2.1 前言

2.2实验耗材及仪器

2.3实验动物与细胞

2.4苯乙醇胺A单克隆抗体的制备

2.5结果与讨论

2.6本章小结

参考文献

第三章 苯乙醇胺A间接ELISA检测方法的建立

3.1实验耗材及仪器

3.2间接竞争酶联免疫吸附分析方法的建立

3.3胶体金免疫层析试剂条的制备

3.4结果与讨论

3.5本章小结

参考文献

第四章 沙丁胺醇单克隆抗体的制备

4.1 前言

4.2实验耗材及仪器

4.3实验动物与细胞

4.4沙丁胺醇单克隆抗体的制备

4.5结果与讨论

4.6本章小结

参考文献

总结

硕士期间发表的论文

致谢