功能性聚合物的定点结合对蛋白质生物活性的调控

摘要

蛋白质生物活性的调控在人类健康和疾病治疗中具有重要的意义。如何精确地控制蛋白质的结构和活性等生物学性能是解决其在疾病治疗、分子诊断和组织工程等生物医学领域中应用问题的关键。利用聚合物对蛋白质进行改性从而提高蛋白质性能的研究受到越来越广泛的关注。聚合物与蛋白质表面的定点结合可以得到结构可控的蛋白质-聚合物偶联物，其中聚合物的性质以及在蛋白质表面的引入位点是关系其最终应用性能的重要因素。
　　本论文的主要工作是制备多种功能性聚合物定点改性的蛋白质，系统研究聚合物的种类及其与蛋白质的结合位点对蛋白质生物学性能的影响。具体研究内容如下：
　　首先，制备了一系列不同位点处含有巯基的模型蛋白质。通过基因重组的方法获得了野生型无机焦磷酸酶（PPase），通过基因定点突变的方法在PPase表面特定位点处引入半胱氨酸残基，制备了一系列在不同位点处含有巯基的突变型PPase，并最终作为聚合物定点结合的蛋白质模型。通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）表征表达纯化的PPase及其突变体的纯度，通过测定PPase催化焦磷酸钠水解生成正磷酸盐的含量表征PPase及其突变体的活性，通过Ellman法测定PPase及其突变体的自由巯基含量。结果表明：通过突变基因的构建以及突变体蛋白质的表达纯化我们获得了纯度极高的突变体蛋白质，并成功在蛋白质表面的不同位点处引入一个可自由反应的巯基，突变型PPase的活性与突变位点的位置和氨基酸残基种类有关，但总体来说，虽然活性有一定的变化，但这种变化并不会对其后续的研究产生重要的影响，因此获得的突变体蛋白质可以用于下一步研究。
　　然后，制备了生物相容性聚合物聚甲基丙烯酸羟乙酯（pHEMA）与 PPase的偶联物，研究了pHEMA的引入对蛋白质活性和构象的影响，并与小分子巯基修饰试剂对氯汞苯甲酸（PCMB）对蛋白质的影响进行了比较。利用吡啶二硫基功能化的原子转移自由基聚合（ATRP）引发剂引发ATRP聚合制备末端基团功能化的pHEMA；通过核磁共振氢谱（1HNMR）和凝胶渗透色谱（GPC）对聚合物的分子量以及分子量分布进行表征；通过吡啶二硫基功能化pHEMA与靠近活性中心特定位点处含有巯基的突变型PPase（PPaseK148C）之间的化学结合将pHEMA偶联到PPase活性中心附近；通过SDS-PAGE和动态光散射（DLS）表征PPase-pHEMA偶联物的形成；通过活性测定研究PCMB和pHEMA的引入对PPase活性的影响；通过还原剂的还原处理研究 pHEMA和 PCMB对 PPase活性的可逆调控；通过圆二色谱（CD）对 PCMB和pHEMA偶联前后PPase的构象变化进行表征。结果表明：PCMB和pHEMA在PPase表面的引入可以抑制蛋白质的活性，而 pHEMA的引入对蛋白质活性的抑制程度更大。这种抑制作用可以通过不同还原剂的处理而得以消除。并且，这种 PCMB和pHEMA偶联对PPase活性的抑制以及还原剂处理对活性的恢复具有明显的可逆性。PCMB和pHEMA对蛋白质活性的影响是由于其造成了蛋白质三级结构的变化。与小分子 PCMB相比，聚合物pHEMA的结合对蛋白质三级结构的改变更大。还原剂对PPC-PCMB和PPC-pHEMA偶联物活性的恢复是由于其引起PCMB和pHEMA从蛋白质表面的解离，从而使得蛋白质的构象得以恢复。这一蛋白质活性调节的策略有望应用于生物检测、药物释放以及细胞功能调节等领域。
　　其次，制备了pH响应性聚合物聚甲基丙烯酸N,N-二甲氨基乙酯（pDMAEMA）与PPase的偶联物，并研究了pDMAEMA在蛋白质表面不同位点处的引入对蛋白质活性和pH稳定性的影响。通过可逆加成-断裂链转移（RAFT）聚合合成不同分子量的pDMAEMA并利用二硫二吡啶后修饰的方法实现其末端基团的吡啶二硫基功能化；通过1HNMR和GPC对聚合和后修饰反应进行表征；通过pDMAEMA末端吡啶二硫基团与突变型 PPase表面巯基之间的结合分别将聚电解质 pDMAEMA偶联到 PPase表面靠近活性中心（PPaseK148C）以及远离活性中心（PPaseN124C）的特定位点；通过Native PAGE表征PPase-pDMAEMA偶联物的形成；通过不同pH条件下偶联物的粒径和Zeta电势表征pDMAEMA的引入对PPase电荷状态和聚集状态的影响。结果表明：pDMAEMA在蛋白质表面不同位点处的引入对其活性具有不同的影响。靠近活性中心时蛋白质活性受到较为严重的影响，而远离活性中心时对蛋白质活性的影响较小，且在酸性pH下的活性有一定程度的提高。不同分子量pDMAEMA在蛋白质表面远离活性中心位点处的引入均能提高蛋白质在酸性环境中的活性，聚合物分子量越大活性提高的程度越大。pDMAEMA对蛋白质活性的影响是由于其改变了蛋白质的表面电荷状态。聚合物的引入有效防止了蛋白质在pH为4.0到6.0范围内的聚集，使得蛋白质在酸性环境下的活性显著提高。这种在蛋白质表面特定位点处引入聚电解质链的方法为提高蛋白质在极端pH条件下的稳定性提供了新策略。
　　最后，制备了糖聚物聚丙烯酰胺基葡萄糖（pAG）和聚甲基丙烯酰胺基葡萄糖（pMAG）与PPase的偶联物，研究和比较了两种不同类型和分子量的糖聚物对蛋白质表面不同位点的修饰对蛋白质活性的影响。通过 RAFT聚合的方法制备两种糖聚物pAG和pMAG；通过二硫二吡啶后修饰的方法将糖聚物末端基团转化成吡啶二硫基团；通过1HNMR和GPC对聚合和后修饰反应进行表征；通过糖聚物pAG和pMAG吡啶二硫基团与突变型PPase巯基之间的化学偶合分别将pAG和pMAG偶联到PPase表面靠近活性中心（PPaseK148C）以及远离活性中心（PPaseN124C）的特定位点，通过SDS-PAGE表征PPase-糖聚物偶联物的形成。结果表明：糖聚物在蛋白质表面的引入位点对其活性具有极其重要的影响，靠近活性中心结合时蛋白质活性降低，远离活性中心结合时蛋白质活性提高。对于同种糖聚物pAG，分子量不同时对蛋白质的活性影响也有所不同。靠近活性中心时分子量较大的糖聚物降低蛋白质活性的程度较大，而远离活性中心时分子量较小的糖聚物提高蛋白质活性的程度较大。分子量相当的不同糖聚物pAG和pMAG对蛋白质活性的影响没有显著差异。这一结果对蛋白质的糖聚物改性研究具有一定的理论和实际指导意义。
　　总之，本论文构建了一系列聚合物与蛋白质表面不同位点进行定点结合形成的功能性偶联物。从聚合物种类和分子量等性质以及结合位点的角度研究了不同类型聚合物与蛋白质表面不同位点的特异性结合对蛋白质活性和构象等生物学性能的影响，并通过比较和总结获得了一些规律。本论文的工作能够为性质可控的蛋白质-聚合物偶联物的合理设计提供一定的实验依据和理论指导。

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第1章 绪论

1.1 生物分子-聚合物偶联物的研究进展

1.2 蛋白质-聚合物偶联物的研究进展

1.3 聚合物偶联改性蛋白质的位点选择

1.4 课题的提出

第2章 模型蛋白质PPase的确立

2.1 引言

2.2 实验部分

2.3 结果与讨论

2.4 本章小结

第3章 生物相容性pHEMA改性对蛋白质的影响

3.1 引言

3.2 实验部分

3.3 结果与讨论

3.4 本章小结

第4章 pH响应性pDMAEMA改性对蛋白质的影响

4.1 引言

4.2 实验部分

4.3 结果与讨论

4.4 本章小结

第5章 糖聚物改性对蛋白质的影响

5.1 引言

5.2 实验部分

5.3 结果与讨论

5.4 本章小结

第6章 论文总结及展望

6.1 论文总结

6.2 展望

参考文献

附录 缩写

博士论文工作期间科研成果

致谢