幽门螺杆菌感染胃上皮细胞模型的建立及长链非编码RNA NR_026827与胃癌的相关性研究

摘要

目的：
　　幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，H. pylori)是诱发胃癌的重要因素，但H.pylori感染诱发胃癌的分子机制尚不清楚。此外，关于胃癌诊断核酸标记物的报道较少。长链非编码RNA（Long noncoding RNA，lncRNA）是一类转录长度超过200 nt、不具有编码蛋白质功能的RNA，它可在不同层面上调控基因表达水平进而参与肿瘤细胞凋亡调控和肿瘤转移等过程，是良好的研究肿瘤发生机制和进行肿瘤诊断的分子标记物。然而，目前关于lncRNA用于H.pylori诱发的胃癌诊断和胃癌发生机制研究的报道较少。为此，本论文旨在建立H.pylori感染胃上皮细胞的模型，以筛选有望用于胃癌诊断的潜在lncRNA标记物，并初步探讨lncRNA与胃癌的相关性。
　　方法：
　　（1）H.pylori感染胃上皮细胞实验。
　　按常规微需氧方法培养H.pylori NCTC11637标准菌株，用RPMI-1640培养液培养胃上皮U937细胞。然后将不同浓度的H. pylori（100:1 MOI和300:1 MOI）加入到U937细胞中，感染U937细胞不同时间（8 h，24 h和48 h）。同时，用等量的PBS代替H. pylori加入到细胞溶液中作为对照组。通过显微镜观察U937细胞形态的变化，应用流式液相多重蛋白定量（CBA）技术检测细胞中细胞因子IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、IFN-γ和TNF的浓度变化情况，并利用流式细胞仪进行细胞凋亡检测，以确定H. pylori感染胃上皮细胞合适的菌量和时间，确定最佳实验条件。
　　（2）H.pylori感染后的胃上皮细胞lncRNA表达谱差异分析。
　　采用康成公司的Human LncRNA Array v3.0（8×60K）芯片，对H.pylori感染后的U937细胞组和正常U937细胞组进行lncRNA表达谱分析。对lncRNA杂交芯片图像进行数据采集，数据经标准化处理后进行聚类分析及相关性分析，获得lncRNA的差异表达谱，以表达量差异两倍为界筛选 H. pylori感染后的胃上皮细胞表达差异的lncRNA。
　　（3）LncRNA NR_026827在临床标本中的表达量差异验证及与胃癌发展的相关性分析。
　　为了验证经上述细胞实验成功筛选到的lncRNA NR_026827在临床样本中的表达差异情况，利用qRT-PCR方法比较lncRNA NR_026827在H.pylori感染后的U937细胞实验组和正常U937细胞对照组中的表达量。并进一步用qRT-PCR法比较lncRNA NR_026827在40例胃癌样本和对应的癌旁组织中的表达量。在此基础上，进一步分析lncRNA NR_026827在胃癌不同分期中的表达量情况。
　　结果：
　　（1）H.pylori感染胃上皮细胞实验模型的建立。
　　细胞形态学观察结果显示，H. pylori感染细胞的时间不能超过24 h，浓度不能超过100:1 MOI，时间过长或浓度过大均会引起细胞发生显著的凋亡和坏死；进一步对细胞因子浓度分析后发现，细胞因子 IL-6在实验组中的浓度比对照组中的浓度显著升高，且在H.pylori浓度为100:1 MOI时，IL-6在H.pylori感染细胞24 h时浓度达到最高；流式细胞仪细胞凋亡检测结果显示，100:1 MOI的H.pylori处理细胞24h，不会引起细胞发生显著的凋亡或坏死。因此，确定用MOI为100：1的H.pylori菌量感染胃上皮细胞24小时是进行后续基因芯片实验的最佳条件。
　　（2）H.pylori感染后的胃上皮细胞lncRNA表达谱差异分析。
　　利用基因芯片技术对H.pylori感染后的胃上皮细胞实验组和正常细胞对照组进行lncRNA表达谱分析，结果显示，差异表达倍数达2倍以上的上调的lncRNA有79个，下调的lncRNA有52个，其中差异表达倍数达5倍以上的上调的lncRNA有9个，下调的lncRNA有10个。但在差异倍数达5倍以上的19个lncRNA中，18个lncRNA的基因芯片杂交信号较弱，说明其表达量较低，只有一个 lncRNA（NR_026827），其差异倍数高达4841.34，且芯片杂交信号较强，达315135.25。
　　（3)LncRNA NR_026827在临床标本中的表达量差异验证及与胃癌发展的相关性分析。
　　qRT-PCR结果显示，在H. pylori感染的细胞样本中lncRNA NR_026827的表达和芯片的结果一致。在临床胃癌组织样本中也检测到了lncRNA NR_026827的表达，且与癌旁组织相比其表达显著降低，结果与细胞实验中 lncRNA NR_026827经 H.pylori感染后的表达显著降低一致。这些结果表明lncRNA NR_026827可望成为诊断胃癌的潜在生物标记物。我们进一步对lncRNA NR_026827的表达量与胃癌分期的相关性进行了分析，结果显示 lncRNA NR_026827在胃癌不同分期中表达量无明显差异，说明lncRNA NR_026827可能参与了胃癌整个发生发展过程。
　　结论：
　　（1）成功建立了H.pylorii感染感染胃上皮细胞的实验模型，以MOI为100：1的H. pylori菌量感染胃上皮细胞24小时，既能让细胞保持较完整的形态，也能观察到细胞因子IL-6的显著变化。
　　（2）获得了H.pylori感染后的胃上皮细胞lncRNA的差异表达谱，筛选到了可能对于胃癌发生发展具有重要作用的lncRNA NR_026827。
　　（3）LncRNA NR_026827在临床胃癌组织样本较癌旁组织表达显著降低，且在胃癌不同分期中表达量无明显改变，表明了lncRNA NR_026827可望成为潜在的胃癌诊断生物标记物且可能参与了胃癌发生发展的全过程。

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前言

1. 研究背景

2. 研究内容

3. 创新点

第一部分 H. pylori感染胃上皮细胞实验模型的建立

1.材料

2. 方法

3. 实验结果

4. 讨论

第二部分 H. pylori感染后的胃上皮细胞lncRNA表达谱差异分析

1.材料

2. 方法

3. 结果

4. 讨论

第三部分 LncRNA NR_026827在临床标本中的表达量差异验证及与胃癌发展的相关性分析

1.材料

2. 方法

3. 结果

4. 讨论

结论

参考文献

综述: 胃癌中lncRNA的研究进展

攻读硕士学位期间发表的学术论文

致谢