GSK-3β/β-catenin信号通路在磨损颗粒诱导假体周围骨溶解中的作用及机制研究

摘要

目的：探讨氯化锂（LiCl），糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）的一种选择性抑制剂，对钛颗粒诱导炎症性骨溶解的治疗作用。
　　方法：雌性C57BL/6小鼠84只，采用随机数字表法分为4组：对照组（Control），Ti颗粒组（Ti组），LiCl低剂量治疗组（L-LiCl组）和高剂量治疗组（H-LiCl组），每组21只小鼠。Control组仅接受假手术，术后每天灌胃300μl等渗盐水；Ti组在小鼠颅骨表面植入Ti颗粒，术后每天灌胃300μl等渗盐水；L-LiCl和H-LiCl组，Ti颗粒植入后，分别灌胃50或200 mg kg-1d-1LiCl。给药2周后，使用CO2箱处死小鼠，保留颅骨及外周血，分别行micro-CT、组织病理学染色、RT-PCR、酶联免疫吸附试验（ELISA）、放射免疫分析、血常规及血生化等检测。
　　结果：Micro-CT结果显示治疗组颅骨骨溶解现象明显减轻，骨密度、骨体积、骨体积分数L-LiCl组和H-LiCl组分别比Ti组增加23.8％、51.7%，18.1%、45.8%，21.7%、43.9%；骨陷窝数减少了37.5%和59.8%，差异有统计学意义（p<0.05）。H&E染色结果表明，Ti组骨膜内有大量巨噬样细胞，L-LiCl组和H-LiCl组炎症反应明显减轻。Ti组骨溶解面积（BES）和颅骨厚度（BT）分别为（0.13±0.03）mm2、（0.12±0.04)mm，L-LiCl组和H-LiCl组分别为（0.07±0.01）mm2、（0.04±0.008）mm2，（0.16±0.03)mm、（0.22±0.11）mm，与 Ti组比较，差异有统计学意义（p<0.05）。抗酒石酸酸性磷酸酶染色（TRAP）结果显示，Ti组颅骨溶解侧可见大量TRAP阳性细胞，治疗后 TRAP阳性细胞数量显著减少。免疫组织化学染色结果表明 LiCl能增加pSer9-GSK-3β、β-catenin、ALP、Osterix和OPG的表达，抑制RANKL、TNF-α、IL-1β和IL-6的表达，而不影响GSK-3β的表达。RT-PCR结果显示，Ti颗粒显著上调破骨细胞活化相关基因Cath-K、CTR、TRAP、OSCAR mRNA的表达，经治疗后，上述基因mRNA表达水平降低，与Ti组比较差异有统计学意义（p<0.05）。Ti颗粒能抑制β-catenin和axin-2基因mRNA的表达，阻断GSK-3β后β-catenin和axin-2基因mRNA的表达明显增加。ELISA结果表明，LiCl能促进OPG的分泌，抑制RANKL的表达，降低RANKL/OPG比值，与Ti组比较差异有统计学意义（p<0.05）。Ti组I型胶原羧基末端肽（CTX）的表达量为50.72±7.88ng/ml，与Control组36.97±7.85ng/ml比较，差异有统计学意义（p<0.05）；L-LiCl组和 H-LiCl组 CTX表达量分别为52.20±3.86ng/ml和53.38±8.54ng/ml，与Ti组比较差异无统计学意义（p>0.05）。Ti组I型前胶原氨基端肽（P1NP）和骨钙素（OCN）的表达量分别为42.63±6.31ng/ml和41.40±7.76ng/ml，与LiCl治疗组[L-LiCl组：52.53±9.07ng/ml、49.92±5.54ng/ml，H-LiCl组：62.70±9.43ng/ml、58.97±9.62ng/ml]比较，差异有统计学意义（p<0.05）。Ti组颅骨体外培养上清液中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量明显增加，LiCl能抑制上述因子的表达，且抑制作用呈剂量依赖性（p<0.05）。血常规和血生化结果显示药物组白细胞数量，血红蛋白含量，血小板数量，天冬氨酸转氨酶、丙氨酸转氨酶、血尿素氮和肌酐的含量与Ti组比较，差异无统计学意义（p>0.05）。
　　结论：氯化锂通过调节GSK-3β/β-catenin信号通路，促进新骨形成，抑制骨吸收，减轻磨损颗粒引起的炎症性反应，抑制骨溶解。
　　第二部分钛颗粒调控GSK-3β/β-catenin信号通路抑制成骨细胞分化
　　目的：观察Ti颗粒对成骨细胞分化、炎症因子释放以及RANKL和OPG表达的影响，探讨GSK-3β/β-catenin在磨损颗粒调控成骨细胞功能中的作用。
　　方法：以小鼠前成骨细胞系 MC3T3-E1为研究对象，分别以 Ti颗粒，GSK-3β的靶向抑制分子（LiCl）和（或）β-catenin靶向抑制因子（槲皮素）处理。CCK-8法检测MC3T3-E1细胞增殖率；对硝基苯磷酸盐实验检测ALP活性，茜素红染色检测细胞矿化能力；RT-PCR检测Runx2、Osterix、OCN、RANKL、OPG、TNF-α、IL-1β、IL-6、COX-2、β-catenin和 axin-2基因 mRNA含量，Western blot检测 GSK-3β、pSer9-GSK-3β和β-catenin蛋白表达，免疫荧光染色观察β-catenin的亚细胞定位，双荧光素酶报告基因检测Wnt/β-catenin信号通路转录活性，ELISA检测RANKL、OPG、IL-6和PGE2的表达。
　　结果：CCK-8结果表明0.1mg/ml Ti颗粒对MC3T3-E1细胞活性无影响。共培养3d时，Ti组（0.1mg/ml）ALP活性（26.7±2.9 nmol PNPP/min/μg protein）与Control组（37.9±4.2nmol PNPP/min/μg protein）比较，差异有统计学意义（p<0.05）；Ti组Runx2、Osterix和OCN基因mRNA表达明显减少，与Control组比较，差异有统计学意义（p<0.05）；茜素红染色结果提示 Ti组红色深染区域明显减少。进一步研究发现Ti作用后，MC3T3-E1细胞中pSer9-GSK-3β的表达下降，细胞核内β-catenin的含量减少，Wnt/β-catenin信号通路转录活性明显降低。RT-PCR结果发现Ti组β-catenin和axin-2基因mRNA的含量较Control组分别下降了48.6%和45.9%，差异有统计学意义（p<0.05）。加入LiCl（10mM）后，pSer9-GSK-3β表达上调，细胞核内β-catenin含量增加，Wnt/β-catenin信号通路被活化。阻断GSK-3β后，ALP活性上升了31.2%，Runx2、Osterix和OCN基因mRNA含量明显增加，茜素红染色结果也提示LiCl干预后矿化结节明显增多，与Ti组比较，差异有统计学意义（p<0.05）。以β-catenin靶向阻断剂（50μm槲皮素）处理后，LiCl对Wnt/β-catenin信号通路的活化明显减弱，该通路下游靶基因axin-2的表达显著减少（p<0.05）。RT-PCR结果显示，LiCl能促进OPG的表达，抑制 RANKL的表达；ELISA检测结果显示，Ti+LiCl组 RANKL和OPG的含量分别为11.24±2.16pg/ml和2.45±0.32ng/ml，与 Ti组（RANKL：17.36±2.28pg/ml；OPG：0.67±0.17ng/ml）比较，差异有统计学意义（p<0.05）；RANKL/OPG的比值由(25.75±3.21)/103(Ti组)下降到(4.76±0.89)/103（Ti+LiCl组）（p<0.05）。Ti作用后MC3T3-E1细胞中TNF-α和IL-β的表达没有显著变化，IL-6和COX-2基因mRNA的含量与Control组比较分别增加了6.6倍和3.4倍，抑制GSK-3β后，IL-6和COX-2基因mRNA的表达显著降低。ELISA结果显示Ti组IL-6和PGE2的含量分别为694.86±81.59pg/ml和17.68±1.63ng/ml，与 Ti+LiCl组（IL-6：262.82±41.91pg/ml；PGE2：7.32±1.18ng/ml）比较，差异有统计学意义（p<0.05）。
　　结论：磨损颗粒通过活化GSK-3β，阻断β-catenin的核转位，抑制MC3T3-E1细胞成骨分化，上调RANKL/OPG比值，促进炎症因子IL-6和COX-2/PGE2的表达。LiCl通过活化β-catenin信号通路，下调RANKL/OPG的比值，抑制炎症因子IL-6和COX-2/PGE2的表达，并能够阻断Ti对成骨细胞分化的抑制作用。
　　第三部分氯化锂调控成骨细胞抑制磨损颗粒诱导的破骨细胞活化
　　目的：观察LiCl干预MC3T3-E1细胞来源的条件培养基（Li-CM）对磨损颗粒诱导炎症性破骨细胞活化的影响。
　　方法：以小鼠单核/巨噬细胞系 RAW264.7为研究对象，运用条件培养基实验，观察Li-CM对RANKL（50ng/ml）和Ti颗粒（0.1mg/ml）诱导破骨细胞活化的影响。以抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色检测成熟破骨细胞；以骨吸收培养板检测破骨细胞骨吸收能力；以RT-PCR检测Cath-K、CTR、TRAP、OSCAR、NFATc1、MMP-9、TNF-α和IL-1β基因mRNA含量；Western blot检测NFATc1、MMP9、IκBα和p-IκBα表达水平；ELISA检测TNF-α和IL-1β的表达水平。
　　结果：TRAP染色结果显示OB-CM组、Ti-CM组均可见大量的紫红色多核细胞，Li-CM组多核细胞较少，统计分析结果表明 Li-CM（50%）组 TRAP阳性细胞数量（138.8±14.7个/cm2）与Li-CM（0%）组（228.3±22.4个/cm2）比较差异有统计学意义（p<0.01）。RT-PCR结果显示Li-CM组破骨细胞活化相关基因Cath-K、CTR、TRAP、OSCAR、NFATc1和MMP-9表达量显著降低，与Control组比较，差异有统计学意义（p<0.05）。骨吸收培养板结果显示Li-CM（50%）组骨吸收面积比较Control组下降了50.8%（p<0.05）。Li-CM（50%）干预后TNF-α和IL-1β基因mRNA含量显著下降，与Control组比较，差异有统计学意义（p<0.05）；ELISA结果显示Li-CM（50%）组TNF-α和IL-1β的含量分别为481.4±62.8pg/ml和244.2±31.9pg/ml，与Control组（637.9±82.3pg/ml和315.7±37.5pg/ml）比较，差异有统计学意义（p<0.05）。Western blot结果显示RANKL和Ti颗粒能增加p-IκBα、NFATc1和MMP-9的表达，Li-CM（50%）能明显抑制上述因子的表达。荧光素酶报告基因检测结果显示RANKL和Ti干预8h后，NF-κB转录活性增加了9.1倍，而以Li-CM干预后，NF-κB转录活性显著降低，差异有统计学意义（p<0.05）。
　　结论：Li-CM能有效地抑制钛颗粒引起的炎症性破骨细胞活化。

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引言

第一部分 靶向干预GSK-3β/β-catenin信号通路抑制磨损颗粒引起的骨溶解

材料和方法

结果

讨论

小结

参考文献

第二部分 钛颗粒调控GSK-3β/β-catenin信号通路抑制成骨细胞分化

材料和方法

结果

讨论

小结

参考文献

第三部分 氯化锂调控成骨细胞抑制磨损颗粒诱导的破骨细胞活化

材料和方法

结果

讨论

小结

参考文献

结论

综述一;成骨细胞在假体无菌性松动中的作用及研究进展

综述二

英文缩略词表

攻读博士学位期间科研情况

致谢