邻苯二甲酸二丁酯致雄性胎鼠尿道下裂的机制研究

摘要

第一部分、邻苯二甲酸二丁酯对胎鼠睾丸中类固醇激素合成急性调节蛋白的影响及意义
　　目的：研究类固醇激素合成急性调节蛋白（steroidogenic acute regulatory protein，StAR）的表达和活性以及睾酮在尿道下裂胎鼠体内发生的改变，探讨邻苯二甲酸二丁酯（di-n-butyl phthalate，DBP）诱导雄性胎鼠发生尿道下裂的机制。
　　方法：
　　（1）40只孕SD大鼠，随机分为DBP组和对照组。孕第13-19天给予灌胃，DBP组按照800mg/kg体重DBP混合玉米油(DBP和玉米油总量为3ml/kg体重)灌胃，对照组按照3ml/kg体重玉米油灌胃。
　　（2）孕第19天取出胎鼠，观察内外生殖器鉴别出 DBP组中发生尿道下裂的雄性胎鼠及对照组中的雄性胎鼠并分为尿道下裂组和正常对照组，拍摄尿道下裂图片，测量肛门生殖结节距离（anogenital distance，AGD），统计尿道下裂发生率，取各组胎鼠生殖结节用苏木精-伊红染色法（hematoxylin-eosin staining，HE）进行染色。
　　（3）各组胎鼠取血后检测血清睾酮水平，取出各组胎鼠睾丸采用实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，qPCR)、western blot、免疫荧光、酶联免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）检测StARmRNA以及StAR蛋白的表达，用Pearson相关性分析以明确StAR蛋白相对表达量和睾酮含量之间的关系。western blot检测磷酸化ERK1/2蛋白（P-ERK1/2），总ERK1/2蛋白(T-ERK1/2)的表达，并通过两者之间的比值分析睾丸中ERK1/2蛋白的磷酸化水平以明确StAR蛋白的活性高低。
　　结果：
　　（1）尿道下裂组胎鼠的尿道开口于生殖结节腹侧，对照组的开口于生殖结节顶端。尿道下裂组的肛门生殖结节距离（1.77±0.12mm）明显小于对照组（2.25±0.15mm）（P<0.05）。胎鼠尿道下裂发生率为43.3％；
　　（2）尿道下裂组睾酮含量（1.45±0.62ng/ml）低于对照组（4.48±0.93ng/ml）（P<0.05）。尿道下裂组的 StARmRNA、StAR蛋白相对表达量以及P-ERK1/T-ERK1、P-ERK2/T-ERK2分别为2-△△Ct=0.23±0.08、0.33±0.07、0.17±0.03、0.19±0.07，对照组的分别为2-△△Ct=1.00±0.00、1.44±0.19、0.31±0.08、0.43±0.14，两组之间的差异具有统计学意义（P<0.05）。免疫荧光显示睾丸间质细胞中尿道下裂组StAR蛋白的表达少于对照组。尿道下裂组和对照组的Pearson相关系数分别为0.642（P<0.05）、0.851（P<0.05）。
　　结论：DBP不仅在转录和翻译层面降低StAR的表达，可能还通过降低ERK1/2蛋白的磷酸化水平减弱StAR蛋白的活性使睾丸中睾酮合成障碍，进而影响了雄性胎鼠生殖器的发育。
　　第二部分、邻苯二甲酸二丁酯对胎鼠生殖结节中成纤维细胞A/B同型雄激素受体的影响及意义
　　目的：研究尿道下裂胎鼠的生殖结节成纤维细胞中A/B同型雄激素受体（AR-A、AR-B）的表达，同时检测成纤维细胞的增殖能力以及迁移能力，探讨邻苯二甲酸二丁酯致大鼠发生尿道下裂的机制。
　　方法：
　　（1）孕SD大鼠随机分为DBP组和对照组。于怀孕第13-19天，DBP组按照800mg/kg体重DBP溶入玉米油(DBP和玉米油总剂量为3ml/kg体重)后灌胃，对照组按照3ml/kg体重玉米油灌胃。
　　（2）怀孕19天取出胎鼠，鉴别出 DBP组中发生尿道下裂的雄性胎鼠及对照组中的雄性胎鼠并分为尿道下裂组和正常对照组。
　　（3）提取两组胎鼠的生殖结节，用组织块法原代培养成纤维细胞。
　　（4）Western blot检测成纤维细胞AR-A、AR-B蛋白的表达，qPCR检测ARmRNA表达。
　　（5）细胞增殖试验检测细胞增殖能力变化，划痕实验检测细胞迁移能力变化。
　　结果：
　　（1）尿道下裂结果详见第一部分。
　　（2）所得细胞生长状态良好，呈长梭型或多角型，细胞多有细长丝状伪足。免疫荧光结果显示两组胎鼠生殖结节细胞的胞质中均表达波形蛋白。
　　（3）AR-B蛋白在成纤维细胞的胞质和胞核中都有所表达，与对照组相比，尿道下裂组的AR-B蛋白相对表达量（胞质：3.46±0.98 VS0.16±0.07；胞核：2.17±0.58 VS0.13±0.07，P<0.05）下降。AR-A蛋白只在胞核中有所表达，其相对表达量和ARmRNA相对表达量在两组间均无统计学差异。
　　（4）与对照组相比，尿道下裂组成纤维细胞增殖能力下降(96h:0.43±0.04 VS0.34±0.05；120h:0.50±0.04 VS0.41±0.04；144h:0.57±0.06 VS0.47±0.04，P<0.05)；平均迁移距离缩短（12h：0.17±0.04mm VS0.14±0.03mm、24h：0.26±0.05mm VS0.20±0.04mm，P<0.05）。
　　结论：DBP可降低胎鼠生殖结节成纤维细胞中AR-B蛋白的表达，还可降低成纤维细胞的增殖能力及迁移能力，这可能会影响雄性胎鼠生殖器的发育导致尿道下裂的发生。

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前言

第一部分 邻苯二甲酸二丁酯对胎鼠睾丸中类固醇激素合成急性调节蛋白的影响及意义

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

第二部分 邻苯二甲酸二丁酯对胎鼠生殖结节中成纤维细胞A/B同型雄激素受体的影响及意义

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

综述;尿道下裂的发病机制研究进展

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