肿瘤细胞来源钙网蛋白诱导荷瘤小鼠体内MDSCs富集的机制研究

摘要

钙网蛋白（CRT）是主要定位于内质网的保守蛋白，细胞生物学功能广泛，在病理状况下也会被释放到细胞外空间。已有的证据表明，CRT在许多肿瘤组织以及肿瘤患者的体液中高表达，既在肿瘤生成过程中发挥作用，又在抑制血管生成、参与肿瘤免疫监视与清除的过程中扮演着重要角色。因此本实验室前期工作利用小鼠黑色素瘤(B16)系统研究了可溶性 CRT对肿瘤体内外生长的影响，结果显示可持续分泌可溶性CRT的B16细胞(B16-CRT)体外的增殖、迁移以及粘附能力与其对照细胞（B16-EGFP）无显著差异，但其体内成瘤性要明显强于对照细胞，并且诱导一群髓系来源的抑制性细胞(Myeloid-derived Suppressor Cells，MDSCs)在脾脏、血液以及肿瘤组织中富集。进一步利用裸鼠以及MDSCs缺失小鼠的成瘤模型证明MDSCs在B16-CRT荷瘤小鼠体内富集是B16-CRT具有强成瘤性的关键因素。因此本课题主要探讨肿瘤微环境来源的CRT富集MDSC的可能分子机制。
　　本研究首先区分了在 B16-CRT荷瘤小鼠外周富集的MDSCs细胞亚群为G-MDSC(CD11b+Ly6G+Ly6Clow)，而对 M-MDSC(CD11b+Ly6G-Ly6Chigh)无显著影响，因此本课题主要围绕 CRT对 G-MDSC分化及功能的影响进行探讨。MDSCs在体内的分布和富集主要由机体通过以下三个环节进行调控：骨髓细胞向MDSCs方向的分化和增殖；外周MDSCs的存活；MDSCs向其他髓系终末端细胞亚群的分化，包括巨噬细胞，树突状细胞等。本研究从体内、外两个层面对CRT诱导MDSCs的三方面富集机制进行探讨。首先利用BrdU体内掺入的方法比较了B16-CRT与B16-EGFP荷瘤小鼠骨髓中各MDSCs亚群的增殖能力，结果显示 B16-CRT荷瘤小鼠骨髓中的 G-MDSC增殖速度显著高于 B16-EGFP荷瘤小鼠，并且体外利用CRT直接作用于小鼠骨髓细胞，也可促进G-MDSC的增殖。在此基础上，进一步利用过继转移模型验证了骨髓细胞在已建立的B16-CRT荷瘤小鼠体内向G-MDSC的分化速度也远远强于其在B16-EGFP荷瘤小鼠体内的分化速度。B16-CRT以及B16-EGFP荷瘤小鼠脾脏以及外周血中的MDSCs的存活率并无显著差别，但体外CRT可抑制MDSCs的凋亡，提示CRT促进MDSCs的存活可能是其导致MDSCs在荷瘤小鼠体内富集的因素之一。对荷瘤小鼠的脾脏以及外周血中的各髓系细胞比例分析发现，B16-CRT荷瘤小鼠脾脏以及外周血中的 DC细胞比例显著低于对照小鼠，提示CRT可能抑制了MDSCs向DC的分化，进一步利用体外实验验证了CRT本身具有抑制MDSCs向DC分化的能力。此外本实验室前期研究中还发现在肿瘤局部组织MDSCs细胞在B16-CRT荷瘤小鼠中也显著富集，本课题利用体外Transwell系统证明了CRT本身可促进MDSCs细胞的迁移。以上结果证明 CRT可通过促进骨髓中 MDSCs的增殖，促进外周组织中 MDSCs的存活，以及抑制MDSCs向DC的分化诱导荷瘤小鼠体内MDSCs细胞的富集，并通过肿瘤组织中的CRT趋化MDSCs向肿瘤组织中进一步富集，从而促进肿瘤细胞在体内的成瘤。在此基础上，本课题对CRT诱导荷瘤小鼠MDSCs富集的分子机制进行了进一步探索。由于TLR4是可溶性CRT的重要受体之一，且表达于MDSCs表面并发挥重要作用，我们首先考察了B16-CRT体内的强成瘤性在TLR4-/-小鼠体内是否存在。结果显示，B16-CRT在TLR4-/-小鼠体内成瘤性与B16-EGFP无显著性差异，并且对MDSCs细胞的富集作用也可被显著逆转，提示TLR4可能是介导肿瘤来源CRT富集MDSCs的主要受体。进一步利用来源于TLR4-/-荷瘤小鼠的MDSCs验证了CRT促进骨髓中MDSCs的增殖，抑制MDSCs向DC的分化以及诱导MDSCs细胞的迁移均依赖于TLR4受体。据文献报道，S100A8/9是髓系细胞分泌的一类重要的细胞因子，其对MDSCs细胞的增殖、分化及迁移均有直接的影响。本课题的研究结果显示CRT可诱导MDSCs细胞表达S100A8/9，且这种刺激作用依赖于TLR4，进一步利用封闭抗体阻断S100A8/9后可抑制CRT对MDSCs的分化以及迁移的影响。综上所述，本课题提出了肿瘤微环境来源的CRT通过TLR4-S100A8/9这一轴线来诱导MDSCs细胞在荷瘤小鼠体内富集，从而促进肿瘤发生发展的新机制，为CRT在肿瘤发生发展中的作用提出一个新的立足点，也为肿瘤的免疫治疗提供了一定的理论基础。

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第一章 前 言

第二章 材料与实验方法

2.1实验材料

2.2 实验方法

第三章 CRT诱导荷瘤小鼠MDSCs富集的作用环节

3.1 CRT富集荷瘤小鼠MDSCs的亚群分析

3.2 CRT对骨髓MDSCs增殖的影响

3.3 CRT对MDSCs存活的影响

3.4 CRT对MDSCs向其他髓系细胞分化的影响

3.5 CRT对MDSCs迁移的影响

3.6 CRT对MDSCs抑制T细胞增殖功能的影响

3.7 本章小结

第四章 CRT诱导荷瘤小鼠MDSCs富集的分子机制

4.1 介导CRT诱导荷瘤小鼠MDSCs富集的受体研究

4.2 CRT影响MDSCs富集的分子机制探讨

4.3 本章小结

第五章 讨论

5.1 病理情况下体内可溶性CRT的来源

5.2 MDSCs各亚群与肿瘤新生的关系

5.3 可溶性CRT与肿瘤新生的关系

5.4 肿瘤中MDSCs生成与功能

5.5 CRT的受体

5.6 S100A8/9与MDSCs

5.7 总结

文献综述:S100A8/A9对MDSCs功能的影响

参考文献

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