异烟肼诱导家蚕脂肪体损伤及其转录组学分析

摘要

结核病是危害人类健康的三大疾病之一，由于其高发性和高死亡性，成为一个全球性的公共卫生问题。异烟肼(INH)是治疗结核病的首选药物，然而长期和大量服用INH的患者会出现不同程度的肝损伤。为了深入探讨INH类药物的肝毒性机制，本文采用经口暴露的方式，建立了INH对无脊椎动物家蚕脂肪体组织损伤模型，利用RNA-Seq技术比较分析了该模型基因的转录水平变化，探讨了对脂肪体代谢和功能的潜在影响。
　　1 INH引起家蚕脂肪体出现类似哺乳动物肝毒性的损伤
　　5龄第3d的家蚕大造，经口暴露INH（1000 mg/kg）后15min，高效液相色谱HPLC即可检测到INH原药在血淋巴、中肠和脂肪体的存在，组织间原药的累积符合家蚕开放式循环系统特点。超氧化物歧化物（ROS）检测发现，INH处理组脂肪体和血淋巴中 ROS水平明显高于水处理对照组；HE和 DAPI组织切片染色鉴定结果显示，INH处理组脂肪体细胞中出现大量空泡，周围存在很多破碎的细胞和受损的细胞核。随着INH剂量的增加和处理后时间延长，家蚕血淋巴中与哺乳动物肝损伤相关的指标性酶活性丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)的活性显著升高。表明家蚕在INH的作用下出现的脂肪体损伤与INH诱导哺乳动物的急性肝损伤具有相似性。
　　2 INH诱导家蚕脂肪体细胞的基因转录水平改变
　　经口暴露1000 mg/kg（溶液体积100μL）INH后8 h，成功构建两个INH/CK家蚕脂肪体组织的RNA-Seq文库，共获得了10113功能基因，其中差异性表达基因2211，包括1908仅在处理组或对照组特异性表达的基因，还有303个基因表达水平在处理组与对照之间显著性差异。其中INH处理后出现表达的特异性表达基因652个，沉默的基因高达1264个，上调表达的基因85个，还有218个基因下调了表达水平。
　　3 INH转录组文库中差异表达基因的GO功能和KEGG通路分析
　　INH/CK两个文库相比，特异表达基因和差异表达基因的GO功能：生物过程(Biological Process)在三个GO功能分布中差异基因最多，主要存在与生物调节、细胞过程、定位、代谢过程、色素沉着等GO分支中；分子功能(Moleclur Function)中连接(binding)和催化(catalytic)两个 GO分支中差异基因占到该部分的差基因总数的90％；细胞成分(Cellular Component)中与细胞或生物膜有关的GO过程中也含有较多的差异基因。
　　根据药物代谢特点，将差异表达基因所有的KEGG通路总结为10大通路，其中在核损伤通路（46个）、细胞外信号通路（31个）、蛋白代谢通路（27个）、细胞过程（52个）凋亡通路（29个）等都含有较多的差异表达基因。在INH的药物代谢KEGG通路中CYP4E3和GST的基因表达量发生变化，雌蚕和雄蚕脂肪体中GST活性显著下调。与细胞凋亡有关通路：内质网蛋白合成的信号通路中与蛋白质转运和结构、糖基化修饰有关的基因发生了显著性差异表达，线粒体能量代谢通路中细胞色素C和AMPK基因也发生显著性差异表达。INH影响线粒体呼吸链中复合物酶活性变化具有显著地时间和剂量效应。
　　家蚕脂肪体中自噬基因 Atg6和Atg8的表达量没有上调表达。

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第一章 文献综述

1 结核病研究现状

2 主治药物异烟肼的研究进展

3 药物性肝损伤

4 INH造成肝损伤的机制研究现状

5药物肝毒性替代动物研究进展

6 转录组测序技术以及在毒理方面研究应用

第二章 研究内容与方法

1 研究目的和意义

2 研究内容

3 技术路线

4 试验动物

5 主要试剂

6 主要仪器

7 试验方法

第三章 结果与分析

1 HPLC检测INH经口暴露后，在家蚕各组织中的分布

2 INH经口暴露诱导家蚕各组织活性氧水平提高

3 INH对家蚕脂肪体组织造成的损伤

4 肝损伤有关的酶活指标的测定

5 INH诱导家蚕脂肪体的转录组学文库信息分析

6 INH诱导家蚕脂肪体表达基因差异性分析

7 差异表达基因的KEGG通路分析

8 差异基因的qRT-PCR验证

9讨论

第四章 结论与展望

1 综合结论

2 后续研究展望与建议

参考文献

附录

发表论文与参与项目

攻读学位期间公开发表论文

攻读学位期间授权发明专利

攻读学位期间参与项目

致谢