RUNX1T1在海马放射状胶质细胞向神经元分化中的作用

摘要

RUNX1T1又称为MTG8或ETO，作为重要的转录因子参与各个系统的发育调控。目前，RUNX1T1在白血病发病机制方面的研究较多，而在神经系统中的作用研究甚少，主要认为该因子可作为共抑制子参与神经系统发育过程中细胞的增殖和向神经元分化。为研究RUNX1T1在海马神经再生中调控海马放射状胶质细胞向神经元分化的作用，本研究主要探讨RUNX1T1在海马神经再生中所起的作用。
　　一目的：
　　观察海马神经再生微环境刺激下，“激活”的星形胶质细胞自身发生的变化及对海马神经再生的影响；观察切割穹窿海马伞海马中RUNX1T1 mRNA和蛋白表达的时相变化及其定位；体外模拟海马神经再生微环境，观察海马放射状胶质细胞表达RUNX1T1以及向神经元分化情况；体外沉默和过表达RUNX1T1后对海马放射状胶质细胞分化为神经元的影响；体内沉默和过表达 RUNX1T1后对海马神经再生的影响，明确RUNX1T1与海马神经再生的关系。
　　二方法：
　　（1）切割大鼠双侧穹窿海马伞并且制备正常及切割穹窿海马伞海马提取液；
　　（2）体外培养星形胶质胶质，在培养液中加入正常及切割穹窿海马伞海马提取液，“激活”星形胶质胶质，检测其共表达BLBP、Vimentin、Nestin、Sox2与GFAP的情况；
　　（3）制备“激活”的星形胶质胶质条件培养基，培养海马NSCs，检测NSCs的存活、迁移和分化为神经元的情况；
　　（4）ELISA检测条件培养基中聚集素蛋白（Clusterin，CLU）的含量，体外检测Clusterin蛋白诱导海马NSCs向神经元分化的情况；
　　（5）制备切割右侧穹窿海马伞大鼠模型，分别于术后第3d、7d、14d、21d、28d检测RUNX1T1 mRNA和蛋白表达情况；
　　（6）体外培养海马 RGCs，在培养液中加入正常和切割海马提取液，观察海马提取液促进RGCs表达RUNX1T1以及向神经元分化的作用；
　　（7）将siRNA-RUNX1T1干扰慢病毒和LV-RUNX1T1-overexpression过表达慢病毒分别转染至体外培养的海马RGCs中，检测海马RGCs中RUNX1T1 mRNA和蛋白表达，以及向神经元分化情况；
　　（8）将siRNA-RUNX1T1干扰慢病毒注入切割穹窿海马伞大鼠海马齿状回中，观察海马齿状回中新生DCX阳性神经元的情况；
　　（9）将LV-RUNX1T1-overexpression过表达慢病毒注入正常大鼠海马齿状回中，观察海马齿状回中新生DCX阳性神经元的情况。
　　三结果：
　　（1）切割穹窿海马伞大鼠海马提取液“激活”的星形胶质细胞，胶质前体细胞的标记物BLBP、Vimentin和神经干细胞的标记物Nestin、Sox2表达显著增强，出现较多的Nestin+/GFAP+细胞和Sox2+/GFAP+细胞；
　　（2）“激活”星形胶质细胞的条件培养基培养的海马神经干细胞球，球内细胞的存活和发育状态明显较好；在膜穿孔实验中，用“激活”星形胶质细胞的条件培养基诱导的海马神经干细胞，其发生迁移的数量显著较多；并出现更多数量的海马神经干细胞分化成MAP-2阳性神经元，且神经元的突起也长而丰富；
　　（3）对制备的各组条件培养基进行ELISA检测，结果显示切割组12h、24h、48h中的 Clusterin蛋白浓度均明显高于对照组和正常组，其中切割24h组达到它们的4倍；利用Clusterin在体外诱导海马神经干细胞分化，观察到Clusterin能明显促进更多的海马神经干细胞向神经元分化，并且分化的神经元与空白对照组相比，其突起更长、更丰富；
　　（4）切割穹窿海马伞后不同时间点，海马组织中RUNX1T1的表达水平发生了变化，在切割3d组中RUNX1T1 mRNA和蛋白的表达明显上调，并达到高峰，此后迅速下降；免疫荧光检测进一步显示，在海马齿状回中RUNX1T1阳性细胞主要分布于颗粒下层，在正常组中仅见少量的 RUNX1T1阳性细胞，切割3d组中 RUNX1T1阳性细胞数迅速增加，并达到高峰，在7d组，RUNX1T1阳性细胞数逐渐减少，21d组，基本恢复到正常水平；
　　（5）用切割穹窿海马伞海马提取液培养海马RGCs，体外模拟海马再生微环境，结果观察到“激活”的海马RGCs中RUNX1T1 mRNA和蛋白的表达量均明显上调，分别约为2.9倍和2.4倍，并且更多的海马RGCs可向MAP-2阳性神经元分化；
　　（6）在RUNX1T1-RNAi有效地下调海马RGCs中RUNX1T1的表达后，观察到仅有3.20％±2.31%细胞分化成 MAP-2阳性神经元，明显少于对照组和空病毒组，而且细胞突起也明显较短、较少。相反，用过表达慢病毒LV4-RUNX1T1-overexpression转染海马 RGCs，上调海马 RGCs中 RUNX1T1的表达，28.31%±5.05%细胞表达MAP-2，与对照组和空病毒组相比，阳性细胞数量明显明显增多，细胞突起显著变长而丰富；
　　（7）将构建的siRNA-RUNX1T1干扰慢病毒载体注入切割穹窿海马伞海马齿状回中，检测到海马中RUNX1T mRNA及蛋白的表达显著下调，海马齿状回中新生的DCX阳性神经元数也明显减少；而在正常海马齿状回中注射LV-RUNX1T1过表达慢病毒载体，上调RUNX1T mRNA及蛋白的表达，则观察到更多的新生DCX阳性神经元，细胞的突起更长更丰富。
　　四结论：
　　（1）切割穹窿海马伞大鼠海马提取液“激活”的星形胶质细胞，高表达胶质前体细胞标记物和神经干细胞标记物，逆转化成放射状胶质细胞，具有胚胎源性；
　　（2）“激活”的星形胶质细胞可促进海马神经干细胞存活、迁移和向神经元分化；
　　（3）“激活”的星形胶质细胞分泌更多的 Clusterin蛋白，从而促进海马神经干细胞向神经元分化；
　　（4）穹窿海马伞切割后海马内RUNX1T1 mRNA和蛋白表达在早期呈短暂性上调，并定位于海马齿状回颗粒下层；
　　（5）切割穹窿海马伞海马提取液促进RGCs上调RUNX1T1和向神经元分化
　　（6）体外下调RGCs中RUNX1T1的表达，可抑制RGCs分化成MAP-2阳性神经元；而上调RUNX1T1在RGCs中的表达，则能促进更多的RGCs向MAP-2阳性神经元分化；
　　（7）海马内RUNX1T1的表达水平可调控海马齿状内的神经再生。

目录

封面

声明

中文摘要

英文摘要

目录

前言

参考文献

第一部分 星形胶质细胞“激活”后向RGCs的逆分化及其分泌的Clusterin对海马NSCs向神经元分化的作用

材料和方法

1 材料

2 方法

结果

1 星形胶质细胞纯化鉴定

2 星形胶质细胞的“激活”

3 条件培养基诱导海马神经干细胞迁移和向神经元分化

4 “激活”的星形胶质细胞分泌聚集素蛋白（Clusterin）

5 聚集素蛋白体外诱导海马神经干细胞向神经元分化

讨论

参考文献

结论

第二部分 RUNX1T1在海马神经再生中的作用

实验一 穹窿海马伞切割后大鼠海马内RUNX1T1 mRNA和蛋白的表达变化

材料和方法

结果

讨论

参考文献

小结

实验二 海马提取液促进海马RGCs表达RUNX1T1及向神经元分化

材料和方法

结果

讨论

参考文献

小结

实验三 RUNX1T1对体外培养的海马RGCs向神经元分化的影响

材料和方法

结果

讨论

参考文献

小结

实验四 RUNX1T1促进大鼠海马齿状回神经再生研究

材料和方法

结果

讨论

参考文献

小结

结论

综述放射状胶质细胞与神经发生

附录

博士研究生期间发表的论文

参加会议及科研获奖情况

致谢