子痫前期血液高凝的分子机制研究

摘要

第一章：中性粒细胞胞外诱捕网形成与子痫前期
　　目的：
　　子痫前期（Preeclampsia，PE）是妊娠期特有的一种疾病，是导致孕产妇和围产儿死亡的主要原因之一。血液高凝状态和微血管血栓形成是子痫前期常见的并发症。子宫胎盘血管内血栓形成，减少母体-胎儿间血供，严重者可导致弥散性血管内凝血（Disseminated intravascular coagulation，DIC）和器官功能障碍。尽管其临床意义重大，子痫前期妇女血液高凝状态及血栓形成机制尚不清楚。最近研究发现，中性粒细胞存在一种特殊的死亡形式即中性粒细胞细胞坏死（NETosis），释放染色质纤维和颗粒内容物形成中性粒细胞胞外诱捕网（Neutrophil extracellular traps，NETs）。NETs成分包含DNA、组蛋白和中性粒细胞颗粒蛋白，如髓过氧化物酶（Myeloperoxidase，MPO）和弹性蛋白酶，这些成分具有促凝和促血栓形成的作用，参与动静脉血栓形成过程。本章节旨在通过体内外实验研究子痫前期相关的NETosis，阐明子痫前期血液高凝状态和血栓形成的分子机制。
　　方法：
　　1．分析正常妊娠和子痫前期妇女临床凝血指标，包括：活化部分凝血酶时间（Activated partial thromboplastin time，APTT），凝血酶原时间（Prothrombin time，PT），血浆D-二聚体（D-dimer）和抗凝血酶III（Anti-thrombin III，ATIII）来验证子痫前期妇女的血液高凝状态。
　　2．收集正常未孕、正常妊娠及子痫前期妇女血浆，采用核酸结合荧光染料PicoGreen检测血浆游离DNA水平，以明确子痫前期妇女血浆DNA水平是否升高。同时分析子痫前期妇女血浆游离DNA水平与患者的收缩压（Systolic blood pressure，SBP）和舒张压（Diastolic blood pressure，DBP）之间的相关性；此外，我们还收集正常对照和高血压（Hypertension，HT）患者的血浆、正常妊娠和子痫前期妇女产前和产后血浆。检测血浆游离DNA水平，以明确子痫前期妇女血浆DNA水平的升高与患者血压的升高有关还是与妊娠过程有关。
　　3．分析子痫前期妇女血浆游离DNA水平与患者的白细胞（White blood cells，WBC）和中性粒细胞数量之间的相关性。采用酶联免疫吸附试验（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）方法测定正常未孕妇女、正常妊娠及子痫前期妇女血浆中性粒细胞标志物髓过氧化物酶MPO的含量。同时分析血浆游离DNA水平与血浆MPO含量之间的相关性，明确升高的DNA是否来源于激活的中性粒细胞。
　　4．采用ELISA方法测定正常未孕、正常妊娠及子痫前期妇女血浆游离核小体（DNA和组蛋白构成的复合体）含量。同时分析血浆游离 DNA水平与核小体含量之间的相关性。
　　5．采用Percoll非连续密度梯度离心法，分离健康人外周血中性粒细胞。采用瑞氏-吉姆萨染色方法和台盼蓝染色方法分别检测中性粒细胞纯度和存活率。收集正常未孕、正常妊娠及子痫前期妇女血浆，刺激正常人外周血分离的中性粒细胞，利用核酸结合荧光染料PicoGreen检测中性粒细胞培养上清中游离DNA含量。利用细胞免疫荧光（Immunofluorescence，IF）的方法观察NETs形成。
　　结果：
　　1．与正常妊娠妇女比较，子痫前期妇女凝血指标变化如下：APTT、PT明显缩短，血浆D-dimer含量显著升高，ATIII活性显著降低。
　　2．与正常未孕妇女比较，正常妊娠和子痫前期妇女血浆游离DNA水平显著升高；子痫前期妇女更明显。子痫前期妇女血浆游离DNA水平与SBP或DBP无显著相关。与正常对照组比较，高血压患者血浆游离DNA水平无显著变化。正常妊娠及子痫前期妇女血浆游离DNA水平产后较产前显著降低，接近正常未孕妇女。
　　3．子痫前期妇女血浆游离DNA水平与WBC数量或中性粒细胞数量呈正相关。子痫前期妇女血浆MPO水平较正常未孕和正常妊娠妇女均显著升高。血浆游离DNA水平和MPO水平呈正相关。
　　4．子痫前期妇女血浆核小体水平较正常未孕和正常妊娠妇女均显著升高。血浆游离DNA水平和核小体水平呈正相关。
　　5．Percoll非连续密度梯度离心法分离得到的人外周血中性粒细胞纯度和细胞存活率均>95％。与正常未孕血浆刺激组比较，正常妊娠和子痫前期妇女血浆刺激组上清游离DNA含量显著升高，NETosis的细胞百分比显著升高；子痫前期妇女血浆刺激作用更强。
　　结论：
　　本章节研究显示，子痫前期妇女体内存在血液高凝状态。子痫前期妇女体内NETosis增加。子痫前期妇女血浆在体外具有促NETosis的活性。由于NETs成分具有促凝和促血栓形成的特性，NETosis增加很可能是子痫前期血液高凝状态及微血管血栓形成的一个重要机制。
　　第二章：微粒触发NETosis与子痫前期
　　目的：
　　在第一章的研究中,我们发现子痫前期妇女体内NETs形成增多，患者血浆具有促NETosis的活性，但NETosis的触发因素不明确。微粒（Microparticles，MPs）参与凝血、炎症、细胞活化、内皮功能障碍等过程。微粒可能也参与子痫前期发病过程。本章研究旨在明确子痫前期妇女血浆 MPs是否为激活中性粒细胞形成NETs的主要触发因素。
　　方法：
　　1．离心法分离正常未孕、正常妊娠及子痫前期妇女血浆 MPs，用无 MPs（MP-free）血浆及MPs刺激分离的健康人外周血中性粒细胞。采用核酸结合荧光染料PicoGreen检测中性粒细胞上清中游离DNA水平；采用细胞免疫荧光（IF）方法观察NETs形成。
　　2．用多种细胞表面标记物抗体标记MPs，采用流式细胞术（Flow cytometry，FCM）分析正常未孕、正常妊娠及子痫前期妇女血浆MPs总数及不同细胞来源MPs数量。
　　3．收集肿瘤坏死因子α（Tumor necrosis factor，TNFα）刺激人脐静脉内皮细胞（Human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）产生的内皮细胞来源的MPs（Endothelial MPs，EMPs），作用于分离的健康人外周血中性粒细胞，利用核酸结合的荧光染料PicoGreen检测上清中DNA含量。
　　结果：
　　1．与正常未孕妇女血浆MPs刺激组比较，正常妊娠和子痫前期妇女血浆MPs刺激组培养上清游离DNA水平显著升高，NETosis的细胞百分比显著升高。正常妊娠和子痫前期妇女血浆MPs刺激作用比无MP血浆刺激作用更强。
　　2．与正常未孕及正常妊娠妇女比较，子痫前期妇女MPs总数显著升高。血浆MPs总数与血浆游离DNA水平之间呈正相关。
　　3．与正常未孕及正常妊娠妇女比较，子痫前期妇女血浆CD62e+ EMPs、CD31+/CD41- EMPs和胎盘来源的MPs数量显著增加；CD62e+ EMPs、CD31+/CD41- EMPs数量为胎盘来源MPs的7倍。血浆CD62e+ EMPs和CD31+/CD41- EMPs数量均与血浆游离DNA之间呈正相关。而CD41+-、CD235a+-和CD45+-MPs数量，三组之间无显著差异。
　　4．与对照组比较，TNFα诱导HUVEC产生的EMPs作用后，中性粒细胞释放的DNA显著增加。
　　结论：
　　本章节研究显示，子痫前期妇女血浆促NETosis的作用主要是由血浆MPs介导。子痫前期妇女血浆中升高的 MPs主要来源于内皮细胞。同时，EMPs在体外具有促进中性粒细胞DAN释放的作用。子痫前期妇女由于某些原因导致内皮细胞活化或凋亡，释放EMPs增加，促进NETosis。
　　第三章：高迁移率族蛋白B1在子痫前期发病过程中的作用
　　目的：
　　在第二章的研究中，我们发现子痫前期妇女由于某些原因导致内皮细胞活化或凋亡，释放EMPs增加，促进NETosis。已知胎盘缺氧在子痫前期发生中起关键作用。胎盘缺氧可导致滋养细胞发生坏死和凋亡。本章节旨在寻找并验证胎盘缺氧过程中滋养细胞产生的具有促进EMPs释放，进而促进NETosis的物质。
　　方法：
　　1．人绒毛膜癌细胞JEG-3在正常氧（20% O2）或缺氧（1% O2）环境下培养，用正常及缺氧JEG-3细胞的条件培养液（Conditioned medium，CM）刺激人脐静脉内皮细胞（HUVEC），采用FCM检测HUVEC细胞上清中EMPs含量。
　　2．用正常氧和缺氧JEG-3的无MPs（MP-free）CM及MPs刺激HUVEC，采用FCM检测HUVEC细胞上清中EMPs含量。
　　3．利用Millipore不同分子量截留的超滤管将正常及缺氧JEG-3细胞CM分成?100 kDa、?50 kDa及?3 kDa CM，再刺激HUVEC，采用FCM检测HUVEC细胞上清中EMPs含量。
　　4．用液相色谱-质谱（Liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）蛋白组学方法，寻找正常及缺氧JEG-3细胞CM中的差异蛋白。
　　5．缺氧JEG-3细胞CM用高迁移率族蛋白B1（High mobility group box1，HMGB1）的中和抗体免沉去除HMGB1或加入HMGB1抑制剂Box A或甘草酸（Glycyrrhizic acid，GA）后，刺激HUVEC，采用FCM检测HUVEC释放的EMPs数量。
　　6．实时定量聚合酶链式反应（Quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）方法检测滋养细胞HMGB1 mRNA表达，蛋白质免疫印迹法（Western blotting）及细胞IF方法检测滋养细胞HMGB1蛋白表达。膜联蛋白V-7AAD（Annexin V-7AAD）检测滋养细胞的凋亡细胞数。ELISA方法检测上清中HMGB1蛋白含量。
　　7．收集正常妊娠妇女及子痫前期妇女的胎盘组织，qRT-PCR和Western blotting法检测胎盘组织HMGB1 mRNA和蛋白表达。收集正常未孕、正常妊娠和子痫前期妇女血浆，ELISA方法检测血浆中HMGB1含量。并分析血浆HMGB1含量与各凝血指标（APTT、PT、D-dimer和ATIII）之间的相关性。
　　8．人重组HMGB1（Recombinant HMGB1，rHMGB1）刺激HUVEC，采用CCK8方法检测HUVEC细胞存活率。碘化丙啶（Propidium iodide，PI）染色，FCM检测PI染色阳性细胞数。采用 FCM检测 HUVEC释放的 EMPs数量。透射电镜观察rHMGB1诱导产生的EMPs形态。
　　9．收集rHMGB1诱导产生的EMPs，刺激分离的人外周血中性粒细胞，检测培养上清中DNA的含量。采用凝血酶生成试验（Thrombin generation assay，TGA）检测EMPs促进凝血酶生成的活性。
　　结果：
　　1．与正常JEG-3 CM刺激组比较，缺氧JEG-3 CM促进HUVEC释放EMPs。
　　2．与MP-free CM（正常JEG-3）刺激组比较，MP-free CM（缺氧JEG-3）刺激后EMPs数量显著增加；与MPs（正常JEG-3 CM）刺激组比较，MPs（缺氧JEG-3 CM）刺激后EMPs数量无显著变化。具有促EMPs释放作用的物质主要是可溶性蛋白或多肽。
　　3．与对应分子量段的正常JEG-3 CM刺激组比较，CM（缺氧JEG-3）刺激组、<100 kDa CM（缺氧JEG-3）刺激组及<50 kDa CM（缺氧JEG-3）刺激组，HUVEC释放的EMPs显著增加。而<3 kDa CM（缺氧JEG-3）刺激组EMPs数量无显著变化。具有促EMPs释放的物质分子量范围3-50 kDa。
　　4．根据LC-MS蛋白组学鉴定结果，正常CM中不存在，只在缺氧CM中存在的蛋白238个，其中42个蛋白的分子量为>100 kDa，80个蛋白的分子量为50-100 kDa，116个蛋白的分子量为3-50 kDa。分析和比对差异蛋白，锁定候选蛋白HMGB1。
　　5．与缺氧JEG-3 CM刺激组比较，HMGB1被抗体中和后，缺氧CM刺激EMPs释放的作用减弱约72.5%（P<0.05）；HMGB1抑制剂（Box A和GA）处理后，缺氧CM刺激作用分别减弱约72%和100%（P<0.05，P<0.01）。
　　6．与正常氧培养的细胞比较，JEG-3、原代人绒毛滋养细胞（Human villous trophoblast，HVT）1% O2低氧培养12 h，HMGB1 mRNA和蛋白表达水平显著升高；与正常对照组比较，鱼藤酮处理后，JEG-3细胞和HVT细胞中HMGB1 mRNA表达水平显著升高。Annexin V/7-AAD染色，FCM结果发现，1% O2低氧培养24 h及鱼藤酮处理后，细胞死亡率显著增加。ELISA结果发现，缺氧24 h和48 h及鱼藤酮处理后，JEG-3和HVT细胞上清中HMGB1含量显著升高。
　　7．与正常妊娠妇女比较，子痫前期妇女胎盘组织中HMGB1 mRNA和蛋白表达水平升高。与正常未孕和正常妊娠妇女比较，子痫前期妇女血浆 HMGB1含量显著升高。血浆HMGB1含量与血浆游离DNA水平、血浆CD62e+ EMPs和CD31+/CD41- EMPs数量均呈正相关。正常妊娠和子痫前期妇女血浆HMGB1含量与APTT、PT、ATIII呈负相关，与D-dimer呈正相关。
　　8．与正常对照组比较，1和2μg/mL rHMGB1刺激后，HUVEC细胞存活率显著降低；PI染色阳性细胞数量显著增加；HUVEC细胞释放的EMPs数量显著增加；透射电镜实验显示，EMPs直径在100-200 nm。
　　9．与对照组比较，rHMGB1诱导产生的EMPs刺激后，中性粒细胞释放的DNA显著增加。EMPs（80个/μL、240个/μL、800个/μL）均可使凝血酶生成的峰值显著升高，且呈剂量依赖性。
　　结论：
　　通过本章节的研究，我们发现 HMGB1是缺氧滋养细胞产生的能促进 EMPs释放的主要物质。与之一致的是人rHMGB1能损伤内皮细胞，促进EMPs释放。子痫前期妇女胎盘缺氧时，滋养细胞中 HMGB1表达上调，血浆 HMGB1水平升高，EMPs释放增加，进而促进NETosis和血液高凝。
　　总之，血液高凝状态和微血管血栓形成是子痫前期常见的并发症，可导致严重后果，如 DIC和器官功能障碍。目前子痫前期相关的血液高凝机制尚未明确。我们的研究结果表明，子痫前期妇女胎盘缺氧，上调滋养细胞 HMGB1表达，HMGB1入血刺激母体血管内皮细胞产生EMPs，进而促进NETosis和凝血，造成组织缺血，参与子痫前期发病过程。因此，本研究提出了子痫前期妇女血液高凝的一个新分子机制，为早期诊断和防治子痫前期相关的血栓性疾病提供新的思路和治疗靶点。

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引言

子痫前期

子痫前期与血栓形成

中性粒细胞胞外诱捕网与血栓形成

参考文献

第一章：中性粒细胞胞外诱捕网形成与子痫前期

材料与方法

结果

讨论

参考文献

第二章：微粒触发NETosis与子痫前期

材料与方法

结果

讨论

参考文献

第三章：高迁移率族蛋白B1在子痫前期发病过程中的作用

材料与方法

结果

讨论

总结

参考文献

综述:子痫前期病理机制的研究进展

参考文献

缩略词表

博士学位期间发表的论文

致谢