血管粘附蛋白VAP-1在动脉粥样硬化斑块发展中的作用

摘要

动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是一种慢性血管炎症，AS斑块的破裂可导致心肌梗死、脑梗死等临床心血管事件的发生。血管粘附蛋白-1(vascular adhesion protein-1，VAP-1)是一种具有胺氧化酶活性的粘附分子，也被称作氨基脲敏感性胺氧化酶(semicarbazide-sensitive amine oxidase，SSAO)，主要表达在血管内皮细胞、平滑肌细胞和脂肪细胞。膜结合的VAP-1可被基质金属蛋白酶(MMP)酶切成可溶性的分子释放入血液中。这些可溶性的VAP-1仍具有胺氧化酶活力，介导炎细胞的迁移浸润。临床研究发现血清中SSAO的活性与颈动脉粥样硬化的斑块大小成正相关。然而，利用氨基脲灭活LDLr基因敲除小鼠体内VAP-1却促进斑块增大。有趣的是，这些增大的斑块含有更多的VSMCs和胶原，提示灭活VAP-1可稳定动脉粥样硬化斑块。这一作用可能与VAP-1抑制VSMCs表型转换有关。
　　目的:构建VAP-1基因敲除型(knockout，KO)小鼠并建立动脉粥样硬化模型，探究VAP-1在动脉粥样硬化发生发展中的作用。
　　方法:利用Cas9技术致使小鼠VAP-1基因的编码序列(Coding sequence，CDS)发生移码突变，以敲除该基因。应用基因扩增、Westem blot技术对KO小鼠进行基因水平和蛋白水平的表达鉴定。随后将VAP-1KO小鼠回交到LDLr KO小鼠背景上，得到双基因KO(double KO，dKO)小鼠。通过喂食小鼠6/9周的高脂饲料，诱导早期和晚期动脉粥样硬化病灶的形成。利用组织染色技术，免疫组化技术检测VAP-1对病灶发展和斑块稳定性的影响。应用流式细胞技术，免疫荧光化学法探究VAP-1对VSMCs表型转换的影响。
　　结果:VAP-1缺失不影响血清总胆固醇水平。与LDLr KO小鼠相比，高脂饲料喂食的LDLr/VAP-1dKO小鼠体内形成了更大的早期病灶（1.5倍，p＜0.01）。然而，VAP-1的缺失并不影响晚期病灶的大小;对病灶成分的分析发现，dKO小鼠血管内斑块含有减少的巨噬细胞和增多的胶原沉积(巨噬细胞:0.80-fold，p＜0.05(6W-WTD),/0.74-fold,p＜0.001(9W-WTD);胶原:1.4-fold,p＜0.01(6W-WTD)/1.4-fold，p＜0.01(9W-WTD));值得注意的是，dKO小鼠晚期病灶的纤维帽增厚且坏死核含量不变。这些变化提示VAP-1的缺失可增强斑块的稳定性。dKO小鼠外周血中Ly6Chigh的单核细胞数量减少，这可能是病灶中巨噬细胞减少的原因。而动脉粥样硬化斑块中增多的胶原主要来源于分泌胶原的SMCs含量的增加(SMCs:1.3-fold，p＜0.01(6W-WTD)/1.5-fold，p＜0.001(9W-WTD))。VAP-1的缺失还增加了斑块中Ki67阳性增殖SMCs的数量(1.6-fold，p＜0.05(6W-WTD)/1.4-fold，p＜0.01(9W-WTD))。这些结果提示，VAP-1的缺失有助于VSMCs向合成型转变。
　　结论:VAP-1的缺失可以促进斑块中SMCs向合成表型转变。这种转变使病灶中胶原蛋白的含量增加，纤维帽变厚，从而增加了斑块的稳定性。因此，VAP-1有望成为治疗动脉粥样硬化的新靶点。

目录

声明

摘要

综述

一、动脉粥样硬化及其斑块稳定性研究进展

1．动脉粥样硬化概述

2．动脉粥样硬化斑块的形成及其生物学特点

3．影响斑块稳定性的因素

4．增加斑块稳定性对动脉粥样硬化具有重要的意义

1 VAP-1的结构与功能

2．VAP-1在动脉粥样硬化的发展特别是在斑块稳定中的作用

展望

第一部分 VAP-1基因敲除小鼠的构建

1 实验材料

1．1 实验动物

1．2 实验仪器

1．3 主要试剂

1．4 溶液配制

2．实验方法

2．1 LDLr-/-VAP-1-/-小鼠的构建

2．2 VAP-1阳性小鼠蛋白水平的表达鉴定

2．3 统计学处理

结果

3．小鼠基因型鉴定

3．3 VAP-1基因敲除小鼠鉴定结果

结论

第二部分：VAP-1的缺失具有稳定AS斑块的作用

1．实验材料

1．1 实验动物

1．2 实验仪器

1．3 主要试剂

1．4 溶液配制

2．2 SSAO活性检测

2．3 小鼠血压检测

2．4 脂质分析

2．5 免疫组化

2．6 胶原染色

2．7 统计分析

结果

3．1 VAP-1缺失对小鼠体重及血压的影响

3．2．VAP-1基因的缺失对小鼠血清总胆固醇及体内SSAO的活性的影响

3．3．VAP-1的缺失对AS斑块大小的影响

3．4．VAP-1的缺失对AS斑块稳定性影响

讨论

第三部 VAP-1的缺失促进了SMCs表型的转变

1．材料和方法

1．2 主要试剂

2．实验方法

2．1 动物模型的建立

2．2 流式细胞术

2．3．免疫组织化学技术

结果

3．2．VAP-1的缺失增加了AS斑块中α-actin的含量

3．3．VAP-1缺失后导致合成型平滑肌细胞(Ki67+SMCs)数量增多

讨论

参考文献

攻读硕士期间出版或公开发表的论著、论文

附录

致谢