农杆菌介导的红掌转抗菌肽基因研究

摘要

红掌（Anthurium andraeanum）是天南星科花烛属多年生草本花卉，其花叶优美，花型独特，花期较长，深受广大消费者喜爱，目前已成为第二大热带花卉商品。但是，红掌大面积栽培易出现细菌性病害，影响红掌产业的发展，因此开展红掌抗菌转基因研究具有积极意义。目前农杆菌介导法是应用最为广泛的转基因方法，愈伤组织也是常用作遗传转化受体材料。因此，建立高频再生体系和遗传转化体系对于红掌转基因育种研究具有重要价值。
　　本试验在前人研究的基础上，对红掌高频再生体系的建立、外源基因的原核表达和农杆菌介导的遗传转化体系等方面进行了研究，取得了以下试验结果。
　　1、以红掌组培苗为供试材料，以1/2 MS培养基为基本培养基，探讨了细胞分裂素TDZ、外植体处理方式、品种对红掌叶片愈伤组织诱导的影响。结果表明，在TDZ浓度为2.0 mg/L时，对叶片适度切伤处理可提高愈伤组织诱导率，诱导时间缩短，20 d后便可诱导形成肉眼可见的愈伤组织。因此，对红掌外植体适度切伤处理后接种于1/2 MS+TDZ2.0 mg/L+2,4-D0.1 mg/L培养基上最适于脱分化培养诱导愈伤组织。
　　2、以红掌愈伤组织为供试材料，探讨了卡那霉素、潮霉素和头孢霉素三种抗生素对愈伤组织生长与分化的影响。结果表明，红掌愈伤组织对潮霉素敏感性最高，卡那霉素次之，而对头孢霉素敏感度较低。明确了在以红掌愈伤组织为受体材料进行转基因时，使用30 mg/L的潮霉素进行抗性筛选、500 mg/L的头孢霉素进行抑菌培养较为适宜。
　　3、为提高对转化材料的农杆菌抑菌效果，尝试利用纳米抗菌材料进行抑菌试验，探讨了四种纳米抗菌材料对农杆菌及其对红掌愈伤组织生长与分化的影响。结果表明，纳米载银试剂能够抑制农杆菌的生长，其抑菌有效最低浓度为25 mg/L；用25 mg/L纳米载银试剂对农杆菌污染的红掌愈伤组织处理1 d，可有效抑制农杆菌污染，抑菌率达到100％，而红掌愈伤组织和不定芽生长不受影响。
　　4、将抗菌肽基因 AaAMP亚克隆于载体 pET-28a，构建了原核表达载体pET-28a-AaAMP，并将其转入大肠杆菌BL21。经IPTG诱导表达1 h时后，在培养菌体总蛋白Tricine-SDS-PAGE图谱中检测到了差异蛋白质条带，其分子量大小与目标蛋白理论值相符，表明抗菌肽基因能够诱导表达形成抗菌肽蛋白。
　　5、为优化红掌遗传转化体系，主要对愈伤组织的预培养时间和工程农杆菌的共培养时间进行了研究。结果表明，在预培养3d和共培养1d条件下，愈伤组织的农杆菌污染率较低，愈伤组织存活率最高，可以筛选到较多的抗性材料。利用优化的遗传转化体系，将愈伤组织切成1㎝×1㎝×0.5㎝的小块预培养3 d，于工程农杆菌菌液侵染20 min，共培养1 d后，先后转移至培养基进行抑菌及筛选培养，最终获得了潮霉素抗性愈伤组织及不定芽。对红掌抗性材料进行了 PCR检测和PCR产物测序，结果表明抗菌肽基因AaAMP已整合到部分转基因抗性材料中，获得了转抗菌肽基因AaAMP的红掌愈伤组织和不定芽。

目录

声明

引言

第一章 文献综述

1. 1红掌愈伤组织培养研究进展

1. 2红掌遗传育种研究进展

1. 3纳米抗菌材料及其应用研究进展

1. 4研究目的与意义

1. 5 研究内容

第二章 材料与方法

2. 1 试验材料

2. 2 试验方法

第三章 结果与分析

3. 1 红掌愈伤组织高频诱导技术的研究

3. 2 农杆菌介导的红掌遗传转化体系的优化

3. 3纳米抗菌材料在红掌遗传转化中的应用

3.4抗菌肽基因 AaAMP的原核表达

3. 5 抗菌肽基因对红掌的遗传转化及转基因个体的鉴定

第四章 结论与讨论

4. 1 全文结论

4.2 讨论

4. 3 特色与创新

4. 3存在问题及今后课题

参考文献

攻读硕士学位期间发表的论文

致谢