RNA干扰EphB2的上调抑制胶质-纤维疤痕形成并促进轴突生长

摘要

第一部分、胶质-纤维疤痕体外模型的建立
　　目的：建立一种新型的胶质-纤维疤痕体外模型，为中枢神经系统损伤后的修复研究提供可靠的疤痕模型。
　　方法：
　　1.体外原代培养SD大鼠脊髓来源的星形胶质细胞和脊膜来源的成纤维细胞，并培养脊髓前角运动神经元VSC4.1细胞。
　　2.在改良的腔室载玻片系统中，先分隔培养星形胶质细胞和成纤维细胞，约2～3d后待两者互相汇合再进行不同处理，分为三组：不做任何处理任由两种细胞继续生长为单纯共培养组（Normal组）、在细胞交界处对细胞进行划痕损伤为损伤组（Injury组）、添加TGF-β1（终浓度10ng/ml）一起培养为TGF-β1组（TGF-β1组）。
　　3.免疫荧光细胞化学染色：取星形胶质细胞、成纤维细胞和VSC4.1细胞分别进行GFAP、FN和Tuj1的染色来鉴定；取上述不同处理的三组分别进行以下免疫荧光细胞化学染色。
　　（1）进行GFAP和FN免疫荧光细胞化学染色，观察三组的细胞互相作用的形态变化；
　　（2）进行EphB2和FN免疫荧光细胞化学染色，观察三组的细胞中EphB2的表达及定位情况；
　　（3）进行ephrinB2和FN免疫荧光细胞化学染色，观察三组的细胞中ephrinB2的表达及定位情况；
　　（4）进行NG2和FN免疫荧光细胞化学染色，观察三组的细胞中NG2的表达及定位情况；
　　（5）进行phosphacan和 FN免疫荧光细胞化学染色，观察三组的细胞中phosphacan的表达及定位情况；
　　（6）进行neurocan和FN免疫荧光细胞化学染色，观察三组的细胞中neurocan的表达及定位情况；
　　4.制备上述三组不同来源的细胞外基质，将VSC4.1细胞置于原先两细胞交界处培养，观察其轴突生长情况并对其长度进行统计分析。
　　结果：
　　1.星形胶质细胞、成纤维细胞和VSC4.1细胞的体外培养：对星形胶质细胞进行体外培养，通过差速贴壁及摇床过夜等方式纯化，经GFAP免疫荧光细胞化学染色鉴定，星形胶质细胞的纯化率达到95％以上；对成纤维细胞进行体外培养，经FN免疫荧光细胞化学染色鉴定，成纤维细胞纯化率达到95%以上；对VSC4.1细胞进行Tuj1免疫荧光细胞化学染色鉴定。
　　2.两种细胞互相作用的形态变化：Normal组中可见交界处的星形胶质细胞和成纤维细胞各居一侧，极少有交叉；而Injury组两细胞交界处可见两种细胞相互穿插，表现为星形胶质细胞聚集成簇，外有成纤维细胞包围，与成纤维细胞接触的星形胶质细胞与成纤维细胞形成栅栏样结构；在TGF-β1组可见交界处两种细胞紧密聚集一起形成细胞团簇样结构。
　　3.EphB2和ephrinB2的表达情况：在Normal组，EphB2几乎没有表达，ephrinB2有微弱表达；而在Injury组，EphB2和ephrinB2表达均增强，在TGF-β1组也同样表达增强；EphB2和ephrinB2分别主要表达于成纤维细胞和星形胶质细胞。
　　4.细胞外基质的表达情况：在Normal组，neurocan几乎没有表达，而在Injury组和TGF-β1组表达明显增强；而NG2和phosphacan在Normal组中有少许表达，但在Injury组和TGF-β1组，表达更为明显。
　　5.VSC4.1细胞轴突生长情况：VSC4.1细胞生长在三组不同来源的细胞外基质7d后，测量VSC4.1细胞突起长度进行统计分析，结果显示与Normal组相比，在Injury组和TGF-β1组中生长的VSC4.1细胞突起长度明显下降，差异具有统计学意义。
　　结论：在改良的腔室载玻片系统中培养星形胶质细胞和成纤维细胞，经过特殊的划痕损伤处理后，能建立成纤维细胞包裹星形胶质细胞的似胶质-纤维疤痕样结构，且EphB2、ephrinB2分别主要表达于成纤维细胞和星形胶质细胞，表达明显增强；另外NG2、phosphacan和neurocan的表达也均增强，且损伤模型来源的细胞外基质能够抑制VSC4.1细胞轴突的生长。
　　第二部分、RNA干扰EphB2的上调对胶质-纤维疤痕及轴突生长的影响
　　目的：利用RNA干扰下调EphB2的表达，观察对胶质-纤维疤痕和轴突生长的影响及其相关机制的研究。
　　方法：
　　1.运用Real-time PCR和Western blot方法检测两种细胞未损伤组（即正常组）、损伤4h组、损伤2d组、损伤4d组、损伤7d组和损伤14d组的EphB2、ephrinB2的基因和蛋白表达变化。
　　2.运用Real time-PCR方法筛选针对EphB2沉默效果最佳的siRNA片段。
　　3.光镜下观察两种细胞正常组、损伤5d组、损伤7d组和损伤3d加siRNA干扰4d组的形态变化。
　　4.GFAP和FN免疫荧光细胞化学染色观察两种细胞正常组、损伤3d加siRNA干扰4d组、损伤3d加siRNA-Scramble干扰4d组的形态变化。
　　5.Western blot检测：提取两种细胞正常组、正常培养3d加siRNA干扰4d组、损伤7d组、损伤3d加siRNA干扰4d组的蛋白，检测EphB2、ephrinB2、GFAP、FN、NG2、neurocan和phosphacan的蛋白表达情况。
　　6.微流控芯片的两侧胞体室接种VSC4.1细胞，芯片中间的疤痕室除了添加如5中所述处理的4组细胞以外，还加上VSC4.1正常诱导培养基组和CSPGs组，观察各组的VSC4.1细胞突起生长情况并对其长度进行统计分析。
　　7.采用Western blot方法或Real-time PCR方法检测p38磷酸化水平、SOX9蛋白和XT-1基因的表达情况，观察与上述细胞外基质相关的分子表达变化。
　　结果：
　　1.EphB2和ephrinB2的表达情况：基因水平上，EphB2从损伤2d开始表达上调，在4d、7d均维持在同一水平，到14d时表达水平最高；ephrinB2从损伤2d开始表达上调，4d时表达进一步上调，但此后维持在同一水平。蛋白水平上，EphB2从损伤4d开始表达明显上调，但此后维持在同一水平；ephrinB2从损伤2d开始上调，4d时表达更为明显，此后进入平台期。
　　2.EphB2 siRNA筛选结果：Real-time PCR结果显示EphB2 siRNA-2降低EphB2的表达效果最佳。
　　3.两种细胞互相作用的形态变化：光镜观察与GFAP和FN免疫荧光细胞染色结果显示在正常组，两种细胞各居一侧，细胞之间界限明确，没有交叉；当损伤至第5d时，成纤维细胞沿星形胶质细胞划痕损伤的缺口延伸，伸出的细胞呈条索状；当损伤至第7d左右发现星形胶质细胞成簇，且成纤维细胞在星形胶质细胞的外围形成包裹；当在损伤3d加入EphB2的siRNA干扰4d后，两种细胞有交叉，但没有形成包裹；如果损伤3d加入siRNA-scramble干扰4d后，则形态与损伤7d组相似。
　　4.EphB2干扰对胶质-纤维疤痕相关分子的影响：损伤7d时，EphB2、ephrinB2、GFAP、FN、NG2、phosphacan和neurocan表达均上调；损伤3d加EphB2的siRNA进行干扰4d后，EphB2、NG2和neurocan均表达下调，ephrinB2、GFAP、FN和phosphacan未受其影响。
　　5.EphB2干扰对微流控芯片中培养的VSC4.1细胞轴突生长的影响：在CSPGs组、损伤7d组，VSC4.1细胞轴突末端会出现膨大样结构（回缩球），且轴突长度最短；当损伤3d加入EphB2的siRNA进行干扰4d后，轴突的生长明显得到改善。
　　6.EphB2干扰对与细胞外基质相关分子的影响：损伤7d时，p38磷酸化水平提高，SOX9蛋白水平和XT-1基因水平也上调；损伤3d加EphB2的siRNA进行干扰4d后，p38磷酸化水平，SOX9蛋白水平和XT-1基因水平均有所下调。
　　结论：对分隔培养并损伤的星形胶质细胞和成纤维细胞进行EphB2的RNA干扰，两种细胞在交界处有交叉，但未能出现成纤维细胞包裹星形胶质细胞的特殊结构；EphB2、NG2和neurocan蛋白表达下降，但ephrinB2、FN、GFAP和phosphacan的蛋白表达不受其影响；在微流控芯片中发现EphB2表达被干扰能够促进VSC4.1细胞轴突的生长；同时p38蛋白的磷酸化水平、SOX9蛋白水平和XT-1基因水平均下调。以上结果说明，EphB2可能通过p38信号通路调节SOX9的表达，继而调节XT-1的基因水平， 再引起NG2和neurocan的蛋白表达变化，最终影响轴突的生长；而FN、phosphacan等未受干扰影响，有可能由其他通路或分子调控。

目录

声明

前言

参考文献

第一部分 胶质-纤维疤痕体外模型的建立

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

第二部分RNA干扰EphB2的上调对胶质-纤维疤痕及轴突生长的影响

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

综述: 中枢神经系统损伤后胶质-纤维疤痕的形成与作用

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