Beclin1蛋白通过核定位以一种不依赖于自噬的方式参与辐照引起的DNA损伤修复

摘要

目的：Beclin1是细胞自噬这一保守的生物途径中的一个关键蛋白。beclin1基因在早期胚胎发育中起着重要作用，它的表达异常会导致小鼠在胚胎期8.5天死亡。以往的研究认为，引起小鼠胚胎致死的原因是，Beclin1表达异常导致自噬水平的异常，继而使细胞凋亡增加，肿瘤发生概率增加，从而引起胚胎致死。然而，我们的研究发现，这个通常被认为分布在细胞胞质中，参与自噬途径的蛋白，在小鼠的发育过程中，存在动态的从胞质向胞核转移的过程。我们研究的具体目标：（1）Beclin1在细胞核中是否存在自噬以外的重要的生物学功能。（2）Beclin1在细胞核中参与DNA损伤修复的具体作用机制。（3）Beclin1在DNA损伤修复途径中的作用是否依赖于其自噬活性。
　　方法：首先，我们通过利用CRISPR/Cas9技术，体外构建了beclin1基因敲除的HeLa细胞系。分别从基因水平，蛋白水平对筛选的单细胞克隆进行鉴定，最终选取两个克隆用做后续的实验。
　　其次，我们给予野生组以及beclin1基因敲除的HeLa细胞5Gy辐照应激。用成像流式检测DNA双链断裂标记物γ-H2AX点的聚集情况。彗星电泳实验验证成像流式的结果。利用HR和NHEJ质粒报告系统来检测细胞双链断裂修复通路的活性。并且用Western Blotting方法，检测修复通路中的关键蛋白的表达。以及用免疫共沉淀法，检测修复通路中的关键复合物：MNR复合物，DNA-PK复合物的形成。
　　我们对Beclin1蛋白进行分段缺失，来寻找介导其入核的入核序列。重叠PCR（Overlap PCR）构建各种Beclin1功能域缺失的突变体，并给突变体带上HA标签，导入细胞后，分离胞质以及核蛋白，检测肽段核定位情况。
　　利用成像流式技术，检测野生组以及基因敲除组细胞在辐照后LC3点的聚集情况。给予细胞饥饿处理，辐照处理以及Baf-A1（Baflomycin-A1）药物处理，Western Blotting检测LC3蛋白I型向II型转化的情况。透射电镜观察野生组以及基因敲除组中自噬小体的结构。利用LC3/ p62- mCherry- GFP质粒，检测细胞Autophagy Flux水平。
　　利用Pull down技术，在细胞核内，富集获取与Beclin1存在结合作用的蛋白，SDS-PAGE胶分离蛋白，进行银染后，将差异条带送质谱分析，寻找在细胞核中，与Beclin1存在结合作用的蛋白。
　　结果:
　　免疫荧光结果显示,在肝脏组织中，小鼠刚出生时，Beclin1主要分布于细胞胞浆中，此时核内Beclin1蛋白分布较少。之后，Beclin1开始逐渐向核内转移。出生15天左右，总蛋白中将近一半的Beclin1蛋白会分布于细胞核中。从出生20天以后起，大部分Beclin1蛋白都位于胞核中。免疫应该的结果用Western Blotting进行验证。事实上，在整个发育过程中，Beclin1的总蛋白水平几乎维持恒定。并且，在全身多种组织中，观察到Beclin1核定位的现象。
　　利用CRISPR/ Cas9技术构建beclin1基因敲除的细胞系。随机挑取了28个单细胞克隆，进行基因敲除鉴定PCR，其中有5个克隆已无法检测到Beclin1蛋白的表达，测序结果显示，其中有15号和40号细胞克隆，实现了单一的突变，并且能够造成移码突变，实现基因功能的丧失。
　　给予野生组以及beclin1基因敲除组细胞辐照应激后发现，敲除组表征DNA双链断裂的标记物γ-H2AX点的数量显著增加。敲除组中DNA双链断裂损伤修复途径中的两条关键修复通路：HR以及NHEJ途径的活性显著降低，其中HR途径的活性下降了约30倍，NHEJ途径的活性下降了约60倍。修复通路中的一些关键蛋白（Rad51、Rad52等）表达显著下降，或是表现为在辐照后无法正常磷酸化（Chk1、Chk2、p53等）。修复通路中的关键修复复合物（MNR复合物、DNA- PK复合物）的形成也受到了影响。
　　分段缺失Beclin1蛋白并且导入细胞后检测肽段的入核情况后发现，发现位于1-50位以及254-278位的肽端，是其核定位必需的，可能是介导Beclin1蛋白进入细胞核所需的入核序列。
　　成像流式检测自噬小体标记物LC3，结果显示，beclin1基因敲除并没有影响到辐照后的自噬激活。也没有影响到LC3由I型向II的转化。电镜下，我们依然能够观察到自噬小体的形成。利用LC3/p62- mCherry- GFP质粒导入细胞后发现， beclin1敲除后，Autophagy Flux也没有受到影响。
　　Pull down结果显示，在细胞核中，II型DNA拓扑异构酶β（DNA topoisomerase IIβ）与Beclin1存在直接的结合作用，并且这种结合作用，在给予细胞辐照应激后更为显著。并且，我们发现，在受到辐照应激后，Beclin1与DNA topoisomerase IIβ能够迅速地定位到损伤断裂点上，此时Beclin1与γ-H2AX的共定位增加，DNA topoisomerase IIβ与53BP1的共定位增加。而当我们敲低DNA topoisomerase IIβ表达后，则会影响到Beclin1在辐照后定位到损伤断裂点上，证明，Beclin1在DNA损伤修复通路中的作用是依赖于DNA topoisomerase IIβ的。
　　结论：
　　(1) Beclin1蛋白在小鼠发育过程中，逐渐由胞质向胞核转移，最终主要定位在细胞核中。（2）1-50位以及254-278位的肽段，是介导Beclin1蛋白入核的入核序列。（3）beclin1缺失会导致DNA双链断裂损伤修复作用的减弱。（4）Beclin1蛋白参与DNA双链断裂损伤修复作用不依赖于其自噬活性。（5）Beclin1通过与DNA topoisomerase IIβ结合，参与DNA双链断裂损伤修复。

目录

声明

前言

材料与方法

一、材料

1、主要试剂与耗材

2、主要仪器

3、药物和试剂配制

4．实验细胞

二、方法

2、Western blotting检测蛋白表达

3、Cas9质粒的构建与扩增提取

4、质粒转染细胞及稳转细胞系的建立

5、成像流式细胞仪检测自噬水平以及DNA双链断裂水平

6、冰冻切片制作及扫描共聚焦显微镜拍摄

7、电镜的制样与观察

8、胞质及核蛋白的分离提取

9、彗星电泳

10、免疫共沉淀

11、流式细胞仪检测细胞周期

12、荧光定量PCR

13、siRNA干扰

14、构建突变质粒

15、统计学分析

实验结果

一、Beclin 1在小鼠发育过程中存在动态的核转位现象

二、构建beclin1基因敲除细胞系

三、beclin1敲除使细胞DNA双链断裂损伤修复功能减弱

四、1-50及254-278位氨基酸是介导Beclin 1蛋白入核的入核序列

五、Beclin 1在DNA损伤修复中的作用不依赖于其在自噬途径中的功能

六、Beclin 1在细胞核中与DNA拓扑异构酶IIβ存在结合作用

七、Beclin 1参与DNA损伤修复作用依赖于DNA拓扑异构酶Ⅱβ

讨论

综述:Beclin 1在血液肿瘤中的研究进展

博士学位期间公开发表的论文

附录

中英文缩略词汇表

致谢