蓝莓联合益生菌通过对IL22/JAK1/STAT3信号通路的影响改善非酒精性脂肪肝的分子机制

摘要

目的：研究蓝莓联合益生菌通过对IL-22调控的JAK1/STAT3信号通路的影响改善非酒精性脂肪肝的作用机制。
　　方法：
　　1.细胞实验：
　　1.1参照文献配制蓝莓益生菌原液及1 mmol/L的混合游离脂肪酸。
　　1.2按照血清药理学方法制备大鼠10％蓝莓血清、益生菌血清、蓝莓益生菌血清及生理盐水血清。
　　1.3正常人肝细胞株L-02从中国科学院上海细胞生物学研究所细胞库购买。细胞在含90%DMEM、10%胎牛血清、1%非必需氨基酸、1%青链霉素、5%CO2恒温培养箱中细胞呈贴壁生长，24小时更换培养液，细胞约80%-90%融合度时，用0.25%含EDTA胰蛋白酶收集细胞并传代。取对数生长期的细胞进行试验。按各组的实验要求干预、培养、裂解细胞，收集全部细胞裂解液备用。
　　1.4油红O染色观察细胞内的脂质沉积；定量检测细胞内甘油三脂（triglyceride TG）含量；细胞增殖实验（cell counting kit-8 CCK8）检测各组细胞的增殖能力；实时荧光定量PCR（real time quantitative Polymerase Chain Reaction qRT-PCR）检测各组细胞IL-22、JAK1、STAT3、SREBP-1c的mRNA表达；免疫荧光法（immunofluorescence）及免疫印迹法(western blot WB)检测各组细胞IL-22、JAK1、STAT3、SREBP-1c的蛋白表达。
　　2.细胞转染实验
　　2.1细胞培养传代、生理盐水及蓝莓益生菌血清制备方法同前。
　　2.2按照实验要求分别用IL22siRNA-阴性对照组（ IL22siRNA negative control IL22SI-NC）及IL-22siRNA组（IL22siRNA IL22SI）瞬时转染细胞24小时予混合游离脂肪酸诱导细胞脂肪变性。
　　2.3第一阶段细胞培养结果已证实蓝莓益生菌血清改善肝细胞脂肪变性的作用优于二者单独使用，故直接选用蓝莓益生菌血清进行干预。
　　2.4油红O染色观察细胞内的脂质沉积；定量检测各组细胞内TG含量；qRT-PCR检测各组细胞IL-22、JAK1、STAT3、SREBP-1的mRNA表达；WB及免疫荧光法检测各组细胞IL-22、JAK1、STAT3、SREBP-1c的蛋白表达。
　　3.动物实验
　　3.1清洁级SD大鼠40只分为5组。除正常组（100%普通饮食）外，其余大鼠均采用复合高脂饲料制备脂肪肝模型共12周。确认造模成功后再将剩余模型组大鼠随机分为蓝莓组、益生菌组、蓝莓益生菌组，同时上述分组后给予正常饮食，观察8周。
　　3.2苏木素-伊红染色（hematoxylin-eosin staining HE）及油红O染色观察肝细胞脂滴沉积；血生化了解肝功能、血脂变化；免疫组化（immunohistochemistry）及WB检测IL-22、JAK1、STAT3、SREBP-1c的蛋白表达；qRT-PCR检测各组IL-22、JAK1、STAT3、SREBP-1的mRNA表达。
　　4. IL-22siRNA基因沉默实验
　　4.1按实验要求将清洁级SD大鼠40只分为正常组、给予100%普通饮食，其余大鼠均采用复合高脂饲料制备脂肪肝模型，同时予IL-22siRNA阴性对照慢病毒及IL-22siRNA慢病毒腹部肝区注射共12周，取肝脏确认造模及siRNA封闭效果后予蓝莓益生菌原液灌胃（方法同前），同时上述分组后给予正常饮食，共观察8周。
　　4.2 HE及油红O染色观察肝细胞脂肪沉积；血生化了解肝功能、血脂变化；免疫组化及WB检测IL-22、JAK1、STAT3、SREBP-1c的蛋白表达；qRT-PCR检测各组IL-22、JAK1、STAT3、SREBP-1的mRNA表达。
　　结果：
　　1.细胞实验：
　　游离脂肪酸诱导刺激24小时后，与正常组比较，模型组细胞内可见大量脂滴沉积，且TG含量明显升高（P<0.01），IL-22、JAK1、STAT3 mRNA及蛋白表达减弱（P<0.01）、SREBP-1c的表达升高（P<0.01）；蓝莓益生菌血清组细胞内的脂滴沉积、TG含量较模型组、蓝莓血清组及益生菌血清组降低（P<0.01）；IL-22、JAK1、STAT3 mRNA及蛋白表达较模型组、蓝莓血清组、益生菌血清组增强（P<0.01）， SREBP-1c的表达降低（P<0.01），但蓝莓血清组与益生菌血清组之间上述各基因和蛋白表达无显著差异（P>0.05）。
　　2.细胞转染实验
　　IL-22SI与正常组、IL22SI-NC比较，细胞内脂滴异常增多，TG含量增高（P<0.01）， IL-22、JAK1、STAT3 mRNA及蛋白表达明显减弱（P<0.01）、SREBP-1c的表达明显升高（P<0.01）；与IL22SI-NC比较，IL22SI-NC+蓝莓益生菌血清组的细胞内脂滴沉积、TG含量明显减少（P<0.01）、IL-22、JAK1、STAT3 mRNA及蛋白表达明显增加（P<0.01），SREBP-1c的表达明显降低（P<0.01）；与IL22SI比较，IL22SI+蓝莓益生菌血清组的细胞内脂滴及TG含量略有减少（P<0.05）；IL-22、JAK1、STAT3 mRNA及蛋白表达有所增加（P<0.05），SREBP-1c的表达有所降低（P<0.05）。
　　3.动物实验
　　蓝莓益生菌组与模型组、蓝莓组及益生菌组比较：肝脏指数、血清ALT、AST、TC、TG、LDL显著下降（P<0.01），HDL显著升高（P<0.01）；qRT-PCR：蓝莓益生菌组的IL-22、JAK1和STAT3 mRNA表达与模型组、蓝莓组、益生菌组比较显著增高（P<0.01），SREBP-1c表达显著降低（P<0.01）；免疫组化及WB：蓝莓益生菌组的IL-22、JAK1、STAT3的蛋白表达较模型组、蓝莓组、益生菌组显著升高（P<0.01），SREBP-1c表达明显减少（P<0.01）。
　　4. IL-22siRNA基因沉默实验
　　IL22SI与正常组、IL22SI-NC组比较，ALT、AST、TC、TG、LDL显著升高（P<0.01）， HDL显著降低（P<0.01），IL-22、JAK1、STAT3 mRNA及蛋白表达明显减弱（P<0.01）、SREBP-1c的表达明显升高（P<0.01）；与IL22SI-NC相比，IL22SI-NC+蓝莓益生菌组的ALT、AST、TC、TG、LDL明显降低（P<0.01），HDL明显升高（P<0.01）， IL-22、JAK1、STAT3的mRNA及蛋白表达显著升高（P<0.01），SREBP-1c的表达显著下降（P<0.01）；IL-22SI+蓝莓益生菌组较IL22SI组的ALT、AST、TC、TG、LDL略有降低（P<0.05），HDL略有升高（P<0.05）， IL-22、JAK1、STAT3的mRNA及蛋白表达有所增加（P<0.05），SREBP-1c的表达略有减少（P<0.05）。
　　结论：
　　1、细胞及动物实验证实：蓝莓联合益生菌的干预效果优于二者单独使用，能够显著调节肝功能及血脂，并且可增强IL-22的表达，通过激活JAK1/STAT3信号通路，下调SREBP-1c表达，抑制SREBP-1c的作用而改善NAFLD。
　　2、细胞转染实验及IL-22siRNA基因沉默实验证实：通过siRNA沉默IL-22基因表达，肝细胞脂肪变性程度明显加重，表明肝细胞脂肪沉积与IL-22的表达呈负相关，说明IL-22在调节脂代谢过程中起着重要作用；并且通过对比IL22SI-NC+蓝莓益生菌组与IL22SI+蓝莓益生菌组发现，蓝莓联合益生菌在肝功能、脂质代谢紊乱的调节作用虽然明显减弱，但仍然存在差异，有统计学意义，提示IL-22可能为蓝莓联合益生菌影响NAFLD的关键作用因子。推测，蓝莓联合益生菌能增强IL-22表达，激活JAK1/STAT3信号通路起抑制SREBP-1c作用，达到改善NAFLD的目的。

目录

前言

缩略语表

第一部分 蓝莓益生菌血清减轻肝细胞内脂滴沉积作用机制的研究

1材料

2 方法与步骤

3 结果

4 讨论

第二部分 IL22在蓝莓益生菌血清减轻肝细胞内脂质沉积作用中的研究

1 材料

2 方法与步骤

3 结果

4 讨论

第三部分 蓝莓联合益生菌对高脂饮食诱导大鼠肝细胞脂肪变性干预效果及作用机制的研究

1 材料

2 实验方法与步骤

3 结果

4 讨论

第四部分 IL-22在蓝莓益生菌改善大鼠肝细胞脂肪变性中作用的研究

1 材料

2 实验方法与步骤

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

综述:肝脏免疫炎症在非酒精性脂肪性肝病发生机制中的作用

攻读学位期间发表的学术论文、论著及承担的课题

致谢