生长抑制特异蛋白GAS2促BCR-ABL恶性转化的研究

摘要

目的：融合基因BCR-ABL是诱发慢性髓细胞白血病（chronic myeloid leukemia,CML）的重要因素。本论文旨在研究生长抑制特异蛋白GAS2（growth-arrest specific2）促BCR-ABL恶性转化的能力，并初探其作用机制。
　　方法：
　　（1）使用慢病毒载体递送GAS2或GAS2的显性负性突变体（dominant negative form of GAS2,GAS2DN）至小鼠BaF3或BaF3/BCR-ABL细胞中，而后检测GAS2或GAS2DN对这些细胞的Calpain活性、生长及集落生成能力的影响；
　　（2）尾静脉注射各类BaF3细胞进入经致死剂量照射的BalB/C小鼠，这些细胞包括，对照、单独表达GAS2或GAS2DN、单独表达BCR-ABL和共同表达GAS2或GAS2DN与BCR-ABL，比较它们在小鼠体内生成白血病的能力；
　　（3）使用western blot和实时定量PCR（Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR）检测GAS2或GAS2DN对BaF3/BCR-ABL、MEG-01和 K562细胞中线粒体异柠檬酸脱氢酶（isocitrate dehydrogenase,mitochondrial;IDH2）的蛋白和mRNA的表达；
　　（4）使用慢病毒载体递送靶向IDH2的shRNA，并研究IDH2沉默对MEG-01细胞生长和集落生成能力的影响；
　　（5）收集健康供体和CML慢性期（CP）以及急变期（BC）患者骨髓，密度梯度离心，免疫磁珠富集以及流式分选分别得到单个核细胞和CD34+细胞，使用qRT-PCR检测GAS2和IDH2的表达水平。
　　结果：
　　（1）GAS2抑制Calpain活性，但GAS2过表达不影响BaF3细胞或BaF3/BCR-ABL的体外生长和集落生成能力。GAS2DN活化Calpain活性，不影响BaF3的生长与集落生成能力，但显著抑制BaF3/BCR-ABL细胞的生长和集落生成能力。
　　（2）单独过表达GAS2未能诱发白血病，但GAS2显著加快BCR-ABL诱发的白血病（P=0.0001）；GAS2DN显著延缓BCR-ABL诱发的白血病（P=0.0006），且显著减小了疾病小鼠的脾脏与肝脏。我们也证实我国CML患者中，GAS2的表达也随疾病进展而显著增高。
　　（3）GAS2DN抑制MEG-01细胞中IDH2蛋白表达，但不影响其mRNA表达；GAS2和 GAS2DN分别增强和减少IDH2蛋白在BaF3/BCR-ABL细胞中的表达，但两者都不影响其mRNA表达；GAS2DN在K562细胞中也抑制IDH2蛋白表达，且依赖Calpain2。
　　（4）CML患者CD34+细胞中IDH2的mRNA表达显著高于正常对照细胞，IDH2沉默显著抑制MEG-01细胞生长和集落生成能力。
　　结论：GAS2能促进癌蛋白BCR-ABL恶性转化小鼠BaF3细胞诱发白血病的能力，而GAS2DN延缓BCR-ABL的恶性转化能力；GAS2能在转录后水平调控线粒体异柠檬酸脱氢酶（isocitratedehydrogenase,mitochondrial;IDH2）表达，且与Calpain2相关；CML患者CD34+细胞中IDH2的mRNA较正常对照细胞表达显著增高，IDH2沉默抑制CML细胞MEG-01的体外生长。

目录

声明

引言

材料和方法

一、材料

1.1样本及细胞系

1.2主要试剂

1.3主要仪器

二、实验方法

2.1细胞培养

2.2细胞总RNA提取

2.3原代样本收集

2.4荧光定量PCR

2.5蛋白免疫印迹实验（Western blot）

2.6 GAS2慢病毒表达载体的构建

2.7制备慢病毒

2.8细胞增殖和集落生成实验

2.9 Calpain活性的检测

2.10小鼠白血病模型

2.11统计学分析

结果

1、GAS2促进BCR-ABL恶性转化BaF3细胞

2、GAS2DN减弱BCR-ABL恶性转化BaF3细胞的能力

3、GAS2在转录后水平调控IDH2表达

4、IDH2在CML细胞中异常表达并维持白血病细胞生长

讨论

参考文献

综述:人类慢性髓细胞白血病靶向治疗的新进展

攻读学位期间公开发表的论文

主要试剂配制

中英文缩略词汇表

致谢