褪黑素通过激活AMPK信号通路改善LPS引起的老年小鼠血脑屏障损伤

摘要

血脑屏障（BBB）的主要功能是在脑实质与血液之间有选择性的进行物质运输，维持大脑内环境的稳态。由于血脑屏障特殊的生理功能，其在许多退行性疾病中都发挥重要的作用，例如阿尔兹海默症、帕金森病、脑卒中等。老年人群属于易感群体，当老年人面对许多外部与内部的刺激时都容易发生血脑屏障的损伤，而血脑屏障的损伤被认为是许多神经退行性疾病的前兆。败血症是老年人群易得一种疾病，形成败血症的原因有很多，其中一种是由于大量的LPS入血进入循环系统并且败血症能够引起血脑屏障的损伤。非常重要的是，随着年龄的增长，老年的人以及动物体内褪黑素水平都有显著的减少。并且已有研究表明，褪黑素能够减少成年小鼠的血脑屏障损伤，说明褪黑素可能在血脑屏障的保护中发挥一定的作用。因此，我们给予老年小鼠一周的褪黑素，进一步研究褪黑素是否能够改善败血症引起的老年小鼠血脑屏障损伤。
　　目的：提前为老年小鼠补充褪黑素，研究褪黑素是否能够减少败血症引起的老年小鼠血脑屏障损伤。
　　方法：动物选用24-28个月龄的老年小鼠，适应2-3天后，通过腹腔连续注射7天的褪黑素（10mg/kg/day）或者等剂量的生理盐水，在第7天结束的时候腹腔注射LPS(1mg/kg)诱导败血症模型，注射LPS24小时以后通过心脏灌流的方式处死老年小鼠，取脑组织备用。通过伊文斯蓝（EB）和免疫球蛋白（IgG）泄露检测血脑屏障的完整性，用免疫荧光化学染色来检测紧密连接蛋白claudin-5、occludin以及内皮细胞标记物RECA-1、凋亡细胞Caspase-3的表达，通过western blot检测AMPK、NADPH氧化酶的催化亚基gp91phox以及紧密连接蛋白claudin-5和occludin表达。
　　结果：
　　1、LPS能够通过降解紧密连接蛋白claudin-5以及occludin进而破坏老年小鼠血脑屏障完整性；
　　2、LPS是通过抑制AMP激活蛋白激酶（AMPK）的磷酸化激活并且提高gp91phox的蛋白表达降解紧密连接蛋白；
　　3、给予老年小鼠一周的褪黑素能够显著改善LPS诱导的老年小鼠血脑屏障损伤；
　　4、AMPK的激活剂二甲双胍（Metformin）处理小鼠脑微血管内皮细胞（bEND3）显著下调LPS引起的gp91phox蛋白表达。
　　结论:我们的结果表明，褪黑素能够通过激活AMPK以及下调gp91phox蛋白表达从而改善LPS诱导的老年小鼠BBB损伤。

目录

声明

前言

材料和方法

1 实验材料

1.1 实验动物

1.2 药品及试剂

1.3 实验仪器

1.4 溶液配制

2 实验方法

2.2组织处理以及药物给药

2.3 血脑屏障完整性的测定

2.4免疫荧光化学标记检测

2.5 Western blot检测

2.6 小鼠脑微血管内皮细胞（bEND3细胞）培养

结果

1、检测EB泄露确定LPS引起老年小鼠BBB损伤

2、褪黑素能够改善LPS引起的BBB完整性损伤

3、褪黑素能够减轻LPS引起的紧密连接蛋白降解

4、老年小鼠血脑屏障的损伤与内皮细胞死亡无关

5、LPS引起BBB损伤的机制

6、激活AMPK能够阻止LPS引起的BBB损伤

讨论

结论

参考文献

综述:褪黑素对血脑屏障的保护

中英文缩略词表

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致谢