TDP-43在大鼠脑出血后继发性脑损伤中的作用机制研究：磷酸化与核丢失

摘要

第一部分脑出血后TDP-43的蛋白水平及分布变化
　　目的：研究大鼠脑出血（ICH）后血肿周围脑组织中TDP-43蛋白水平；Pi化及分布的变化。
　　方法：随机任选42只大鼠分为假手术组和ICH后3h、6h、12h、24h、48h、72h共7组，每组6只。所有的大鼠在脑出血后相应的时间点被处死。在每组大鼠取血肿周围1.5-2mm范围内脑组织，分离核蛋白与胞浆蛋白，利用免疫荧光和Western blot技术分析检测TDP-43的蛋白水平，Pi化及分布情况。
　　结果：1、实验结果表明，大鼠脑出血后神经元细胞核中 TDP-43水平呈先下降后恢复再下降再稍恢复的变化，以ICH后48h组TDP-43核定位下降最显著（P<0.01）；2、神经元胞浆内TDP-43水平在ICH后逐渐上升的趋势，在48h达到最高值（P<0.01），随后开始下降；3、胞浆内TDP-43磷酸化水平在ICH后逐渐上升，并在48h达到最高值（p<0.01）,随后下降。4、体内与体外的免疫荧光显示TDP-43在脑出血模型48h后核定位达到最低水平，与此同时其在胞浆分布达到最高水平（P<0.01）。
　　结论：ICH后 TDP-43开始从神经元的细胞核内转移到细胞质中，并于出血后的48hTDP-43的胞浆内磷酸化水平及核丢失达到最高。
　　第二部分调控TDP-43对脑出血后继发性脑损伤的影响
　　目的：探索TDP-43磷酸化位点S409/410突变试剂干预后，TDP-43在脑出血后细胞内分布表达变化，及TDP-43突变干预对大鼠脑出血诱发的继发性脑损伤中的保护作用。
　　方法：在体内实验中，任选84只，随机分为假手术组（sham）、脑出血组、脑出血+空质粒组（ICH+ vector）、脑出血+TDP-43质粒组（ICH+ TDP-43WT）、脑出血+TDP-43突变组（ICH+TDP-43MT）、脑出血+control RNA组（ICH+control RNA）、脑出血+TDP-43小干扰RNA组（ICH+TDP-43 siRNA），共计7组（n=12/组）。在转染TDP-43质粒与小干扰RNA后48h于基底节区注射心脏自体血80ul,48h后取出脑组织做切片进行TUNEL染色、Fluoro-Jade B（FJB）染色；每组取6只大鼠的血肿周围脑组织分离胞浆蛋白及核蛋白进行Western Blot分析和免疫荧光分析。在体外实验中，胎鼠中提取培养神经元，随机分为control组、oxyHb组、oxyHb+vector组、oxyHb+TDP-43WT、oxyHb+TDP-43MT、oxyHb+control RNA组、oxyHb+TDP-43siRNA组，共计7组（n=6/组），进行LDH分析。
　　结果：1、Western Blot实验结果表明，ICH能够促进TDP-43磷酸化（p<0.05），突变 TDP-43磷酸化位点 S409/410能够显著降低其磷酸化水平(p<0.05)。2、过表达TDP-43突变体能够显著减少TDP-43在脑出血后胞浆内聚集情况(p<0.05)，减少核丢失(P<0.001)。3、在体内FJB、TUNEL染色及体外LDH表明：过表达TDP-43突变体可以显著降低在脑出血后神经元的凋亡坏死情况(p<0.05)。
　　结论：1、S409/410是TDP-43重要的Pi位点；2、通过突变TDP-43的磷酸化位点S409/410可以减少其在脑出血后的核丢失，改善脑出血所诱导的继发性脑损伤。
　　第三部分 TDP-43参与脑出血后继发性脑损伤的机制研究
　　目的：通过对CN活性的检测来验证其在ICH情况下对TDP-43磷酸化水平的影响;通过磷酸化位点突变技术研究TDP-43潜在的脑保护作用机制。
　　实验方法：
　　在体外实验中通过CN活性试剂盒来测定脑出血及相关干预状态下CN的活性及TDP-43磷酸化水平的变化。在体内实验中，任选30只，随机分为假手术组（sham）、脑出血组、脑出血+DMSO组、脑出血+FK506组、脑出血+CHA组,共计5组（n=6/组），通过Western Blot分析来观察各相关蛋白水平。
　　结果：1、体外实验表明：脑出血后钙调磷酸酶（CN）活性增加，CHA能促进其活性，相比之下FK506能抑制其活性；脑出血后CHA能抑制TDP-43的磷酸化，与此同时FK506能够促进TDP-43的磷酸化。2、体内Western blot实验结果表明：脑出血干预TDP-43突变体后m-TOR及DCTN1的蛋白表达水平显著增加（p<0.05）。3、脑出血后自噬水平较假手术组显著提高（p<0.05）,干预TDP-43突变体后自噬水平较正常脑出血组明显降低（p<0.05）。
　　结论：脑出血后钙调磷酸酶（CN）的活性增加，能够促进PITDP-43的去磷酸化， CHA，FK506可以分别起到促进、抑制作用；突变 TDP-43的磷酸化位点 S409/410可以增加m-TOR的的蛋白表达从而降低自噬小体与溶酶体的生物学效应，在DCTN1的蛋白表达水平增高的情况下，降低了自噬水平，起到改善了继发性脑损伤作用。

目录

声明

前言

第一部分 脑出血后TDP-43的蛋白水平及分布变化

材料和方法

1.材料

2. 实验方法

3．统计学分析

结果

1.大鼠的存活率:

2. 大鼠脑组织细胞核与胞浆内TDP-43表达水平及磷酸化水平的变化

3. 在ICH后大鼠血肿周围脑组织中TDP-43在细胞核与细胞浆的分布情况变化

讨论

结论

第二部分 调控TDP-43对脑出血后继发性脑损伤的影响

材料和方法

1.材料

2. 实验方法

结果

1.大鼠的存活率:

2.过表达TDP-43突变体对ICH后血肿周围脑组织中TDP-43亚细胞分布的影响

3.大鼠脑出血及TDP-43突变体干预后TDP-43磷酸化水平变化

4.大鼠脑出血TDP-43突变体过表达对ICH后神经元凋亡情况的影响

5.大鼠脑出血TDP-43突变体过表达对ICH后脑组织细胞坏死情况的影响：

讨论

结论

第三部分 TDP-43参与脑出血后继发性脑损伤的研究

材料和方法

1.材料

2. 实验方法

3．统计学分析

结果

1.ICH后CN的活性变化及CHA、FK506对TDP-43磷酸化水平的影响

2.大鼠脑出血TDP-43突变体干预后自噬通路相关蛋白m-TOR、DCTN1表达水平变化

3.大鼠脑出血TDP-43突变体干预后自噬水平的变化

讨论

结论

综述:TDP-43在中枢神经系统疾病中的研究进展

攻读学位期间公开发表的文章

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