核定位信号修饰的二氧化钛纳米颗粒在胶质瘤细胞放射增敏作用中的研究

摘要

目的：利用金属基质的氧化物-纳米二氧化钛为内核，通过在其表面修饰牛血清蛋白及核定位信号（nuclear location sequence, NLS）合成一种具有肿瘤细胞核靶向性的纳米颗粒（TiO2-NLS Nanoparticles），以人脑胶质瘤U251细胞作为体外研究对象探讨TiO2-NLS纳米颗粒对其放射敏感性的影响及其机制；构建皮下荷瘤裸鼠模型研究TiO2-NLS纳米颗粒联合X射线对小鼠的治疗效果。 方法：体外实验： 1.在酸性水溶液中，利用二氧化钛的高吸附能力，把牛血清蛋白（BSA）按照一定的比例（1：1）连接到二氧化钛的表面，再将具有核定位能力的多肽通过自由基聚合，连载到二氧化钛纳米颗粒的表面，合成TiO2-NLS纳米颗粒。利用透射电镜（TEM）、动态光散射（DLS）和激光共聚焦显微镜对纳米颗粒的结构形态及细胞中的分布情况进行了表征。2.通过MTT法、克隆形成法检测纳米颗粒联合X射线对脑胶质瘤U251细胞的活力及增殖能力的影响，流式细胞仪分析了TiO2-NLS纳米颗粒联合X射线对U251细胞周期的影响。3.DPPH实验检测纳米颗粒处理组及联合处理组中U251细胞活性氧（ROS）的含量。4.通过激光共聚焦显微镜分析X射线处理12 h和24h后细胞核内γ-H2AX的荧光数量来比较 TiO2-NLS纳米颗粒及联合X射线后对U251细胞的DNA损伤修复水平，以流式细胞仪定量检测TiO2-NLS纳米颗粒及联合X射线对U251细胞凋亡影响。体内实验：1.建立裸鼠皮下肿瘤模型，分别考察了单纯照射和TiO2-NLS纳米颗粒与X射线联合处理对胶质瘤移植裸鼠的治疗效果。2.通过观察HE及Tunel荧光染色切片来分析TiO2-NLS纳米颗粒在肿瘤内的滞留情况及联合X射线后肿瘤细胞的凋亡情况。 结果：1.透射电镜（TEM）结果显示表面修饰牛血清蛋白可以提高二氧化钛纳米颗粒在水溶液中的分散性，DLS测得Tio2、Tio2-BSA、Tio2-NLS三种纳米颗粒在PH=7.4的PBS中粒径大小分别为1025±52、43±25、45±32，zeta电位分别为-25.24±2.30、-2.85±1.50、±5.32±1.58，激光共聚焦显微镜观察到修饰有细胞核定位信号的二氧化钛纳米颗粒可以成功的进入细胞核，未修饰的二氧化钛纳米颗粒大部分滞留在细胞质。2.MTT、细胞克隆实验表明TiO2-NLS纳米颗粒联合X射线能够降低U251细胞的活力和增殖能力，流式细胞仪数据表明Tio2-NLS纳米颗粒可以使细胞阻滞于G2/M期。3.DPPH结果显示TiO2-NLS纳米颗粒能够刺激细胞产生活性氧，在0 Gy条件下与对照组相比提高了1.3倍，联合X射线后与8Gy 照射组相比提高了1.7倍。4.免疫荧光实验表明，TiO2-NLS纳米颗粒可促进X射线对胶质瘤细胞DNA的损伤，细胞完成修复的时间显著延长，流式细胞仪数据显示与单纯照射组相比TiO2-NLS纳米颗粒联合X射线可使U251细胞的凋亡率提高1.55倍。5.体内药效实验证明，与单纯照射组相比TiO2-NLS纳米颗粒联合X射线可以更有效地抑制皮下肿瘤的生长，病理切片镜下可观察到纳米颗粒分布的周围肿瘤组织发生片状坏死，Tunel荧光染色显示TiO2-NLS纳米颗粒联合X射线可以促进肿瘤细胞的凋亡。 结论：连载有细胞核定位信号的二氧化钛纳米颗粒可以成功进入细胞核，纳米颗粒联合X射线作用可有效地抑制皮下胶质瘤的生长，增强X射线对胶质瘤细胞的杀伤能力。

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引 言

参考文献

第一部分 TiO2-NLS纳米颗粒的合成及表征

材料与方法

（一）材料与仪器

（二）实验方法

1.TiO2-NLS纳米颗粒的制备

2.细胞复苏、传代培养及细胞冻存

3.纳米颗粒在细胞中的分布

4.MTT法检测纳米颗粒的细胞毒性

实验结果

1.核定位信号修饰的二氧化钛纳米颗粒（TiO2-NLS）的合成及表征

讨 论

参考文献

第二部分TiO2-NLS 纳米颗粒联合X射线对人脑胶质瘤细胞生物学功能的影响

（一）TiO2-NLS纳米颗粒联合X射线对U251细胞增殖能力及周期的影响

材料与方法

（一）材料与仪器

1.DMEM培养基

（二）实验方法

1.纳米颗粒联合X射线对U251细胞活力的影响

2.细胞克隆形成实验

3．纳米颗粒联合X射线对U251细胞周期的影响

实验结果

1.纳米颗粒联合X射线对细胞活力和凋亡率的影响

2.细胞克隆形成实验

3纳米颗粒联合X射线对U251细胞周期的影响

讨 论

参考文献

（二）TIO2-NLS纳米颗粒对人脑胶质瘤细胞放射敏感性的影响及其机制研究

材料与方法

（一）材料与仪器

（二）实验方法

1.流式细胞仪检测细胞活性氧产生量

2.流式细胞仪器检测细胞摄取荧光纳米颗粒的含量

3.纳米颗粒对U251细胞凋亡率的影响

4.纳米颗粒对U251细胞DNA双链损伤作用

实验结果

1.TiO2-NLS纳米颗粒对U251细胞活性氧产生的影响

2.TiO2-NLS纳米颗粒对DNA损伤修复的影响

3.流式细胞仪检测不同处理组的细胞凋亡情况

讨 论

参考文献

第三部分 TiO2-NLS 纳米颗粒联合X射

材料与方法

（一）材料与仪器

（二）实验方法

实验结果

讨 论

参考文献

全文总结

综 述

中英文缩略词对照

攻读学位期间公开发表的论文

致 谢