敲低cZNF292对乏氧肝癌细胞放射敏感性的影响及其机制研究

摘要

目的：本课题通过建立稳定敲低环状RNA（circle RNA）cZNF292的肝癌细胞系，探讨敲低cZNF292对乏氧肝癌细胞周期、增殖、凋亡及血管生成拟态等细胞表型变化以及放射敏感性的影响及其机制。 方法：利用实时荧光定量PCR (qRT-PCR) 检测乏氧诱导的四种circRNAs在肝癌细胞中的表达。构建cZNF292 shRNA 慢病毒表达载体，转染后建立稳定敲低cZNF292的SMMC7721细胞系。将对照组和敲低组细胞在常氧和乏氧（1%O2）环境中分别培养，通过CCK-8 实验检测细胞增殖能力；流式细胞术检测细胞的周期、凋亡；通过血管生成拟态实验（VM）检测离体培养的SMMC7721细胞管腔样结构的形成能力；分别以克隆形成实验和γH2AX 免疫荧光染色检测敲低cZNF292对SMMC7721细胞辐射敏感性和DNA损伤修复能力的影响；通过RNA结合蛋白免疫共沉淀，qRT-PCR以及Western bolt检测cZNF292与相关蛋白的相互作用及其对Wnt/β-catenin信号通路的调控机制。 结果：SMMC7721细胞circRNA cZNF292 的表达水平随乏氧培养时间的延长而逐渐升高。利用慢病毒载体构建的稳定转染cZNF292 shRNA的细胞系能够有效下调cZNF292的表达。在常氧和乏氧培养环境下，敲低cZNF292 诱导G1期阻滞，增殖能力明显下降。发现在乏氧条件下，敲低cZNF292明显降低乏氧SMMC7721细胞β-catenin，CyclinD1和C-myc蛋白表达水平，增加p21蛋白表达水平。常氧和乏氧培养下，敲低组的管腔样结构的形成能力均被抑制。乏氧条件下，敲低cZNF292组中与血管生成相关的靶蛋白包括β-catenin，Twist1以及VE-cadherin蛋白水平明显下降。在常氧或乏氧培养下，敲低组的辐射敏感性显著高于对照组，敲低组γH2AX foci 数量明显高于对照组。乏氧条件下敲低cZNF292组DNA-PKcs （S2056）水平明显升高，ATM（S1981）蛋白水平无明显变化。cZNF292是定位于胞浆的 circRNA ，可被 SOX9 抗体通过 RIP pulled-down ，敲低 cZNF292 使pulled-down SOX9蛋白水平明显下降，但不影响SOX9蛋白的表达水平。 结论：乏氧诱导肝癌细胞SMMC7721细胞系中cZNF292的表达，敲低cZNF292 导致常氧和乏氧肝癌细胞均发生细胞周期阻滞和增殖抑制，血管腔样结构的形成能力下降以及放射敏感性增强，其机制可能与敲低cZNF292增加SOX9蛋白核转位，明显降低Wnt/β-catenin通路活性有关。

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引 言

参考文献

第一部分 CircRNA cZNF292对乏氧肝癌细胞的诱导表达调控并构建稳定敲低细胞系

材料和方法

一、实验材料

二、实验方法

实验结果

讨 论

参考文献

第二部分 敲低cZNF292对乏氧肝癌细胞表型变化的研究

材料与方法

一、实验材料

二、 实验方法

实验结果

讨 论

参考文献

第三部分 敲低cZNF292对乏氧肝癌细胞放射敏感性的影响及其机制研究

材料和方法

一、实验材料

二、 实验方法

实验结果

讨 论

参考文献

结 论

综 述CircRNA cZNF292 的研究进展

参考文献

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攻读学位期间公开发表的论文

致 谢