IL-21RmRNA在类风湿关节炎患者外周血单个核细胞中的表达水平及其检测意义研究

摘要

目的：建立检测类风湿关节炎患者（rheumatoid arthritis，RA）外周血单个核细胞（PBMC）中IL-21RmRNA的套式实时荧光定量PCR（Nested-Real-Time-PCR）的方法，（1）研究IL-21RmRNA在RA PBMC中的表达水平并探讨其临床意义；（2）探讨IL-21RmRNA在RA骨破坏中的作用，进一步揭示RA的发病机制；（3）探讨IL-21RmRNA与RA患者血清中IL-21（interleukin-21）含量及外周血CD4+CD25+T淋巴细胞数量的相关性；（4）探讨IL-21RmRNA在RA患者中医不同证型中的表达水平及其检测意义。 方法：根据IL-21RmRNA序列，跨内含子设计外引物，采用套式实时荧光定量PCR方法。首次扩增以增加原始模板浓度，并以减少引物、酶的浓度及循环次数的方法保持扩增片段的特异性，再以首次扩增产物为模板，进行二次PCR扩增作实时荧光定量（Real-Time-PCR）检测，同时以β-actin作内参；以二者比值作为IL-21RmRNA表达水平的指标。同时采用竞争性酶联免疫吸附法（ELISE）测定RA患者血清中IL-21的含量，流式细胞术检测EDTA-K2抗凝外周血中CD4+CD25+T淋巴细胞数量。 结果：PCR扩增片段经测序分析证实为IL-21RmRNA的特异性目的片段。Ct值和模板起始浓度对数值之间具有良好的线性关系；检测最低浓度可达101拷贝。ELISA法测RA患者血清中IL-21的含量，相关系数为0.9984。60例RA患者与30例健康人群相比，RA患者组基因IL-21RmRNA表达水平及血清中IL-21含量上调，经统计学分析具有显著差异（P<0.01）。将R患者关节功能分级组别作IL-21RmRNA及IL-21表达水平比较；Ⅰ级、Ⅱ级相比两者均无显箸差异（P>0.05），Ⅰ级、Ⅱ级分别与Ⅲ级以上相比，差异均显著（P<0.01）。RA活动期IL-21RmRNA及IL-21水平均较非活动期增高，RA患者经治疗后两者的表达水平均明显下调；治疗前后比较均具有显著差异（P<0.01）。中医证型之间两两比较均没有显著性差异。将60例RA患者PBMC中IL-21RmRNA的表达水平与血清中IL-21含量及外周血CD4+CD25+T淋巴细胞数量作Pearson相关分析，IL-21RmRNA表达水平与血清中IL-21的含量显著相关，而与外周血CD4+CD25+T淋巴细胞数量无相关性。 结论：RA患者IL-21RmRNA及IL-21的表达水平均显著上调，两者表达水平和RA疾病严重程度有关，检测RA患者PBMC中IL-21RmRNA的表达水平及血清中IL-21的含量可能更有助于了解RA患者的免疫功能，有助于指导RA的治疗；本文建立的检测方法重复性好，敏感且特异，可作为一种常规检测手段应用于临床。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略语中英文对照表

声明

引言

1.研究目的及理论依据

2.国内外研究进展

2.1类风湿关节炎传统医学的研究进展

2.2现代医学对类风湿关节炎的认识

2.3 IL-21R及IL-21的研究概况

2.4 CD4+CD25+免疫抑制性调节性T淋巴细胞研究概况

3.本课题的研究设想及技术路线

3.1研究设想

3.2技术路线

4.预期的结果和意义

4.1预期结果

4.2研究意义

第一部分临床资料研究

1研究对象

2病例选择

2.1诊断标准

2.2纳入标准：

2.3排除标准：

3实验材料

3.1标本收集

3.2仪器与试剂

3.3专业软件

4实验方法

4.1 IL-21竞争性酶联免疫吸附法(ELISA)

4.2 CD4+CD25+T淋巴细胞检测 流式细胞术

4.3 IL-21RmRNA的检测 套式实时荧光定量 PCR(Nested-Real-Time PCR)

5统计分析

6研究结果

6.1检测结果

6.2检测结果分析

第二部分讨论

1 Nested-Real-Time-PCR检测IL-21RMRNA的方法评价

2实验中的质量控制

2.1流式细胞术的质量控制

2.2 Nested-Real-Time-PCR的质量控制

3结果分析

3.1 IL-21含量及IL-21RmRNA基因表达与类风湿关节炎

3.2 CD4+CD25+T淋巴细胞与类风湿关节炎

3.3 IL-21及IL-2lRmRNA水平与中医分型

结论

有待进一步探讨的问题

参考文献

攻读硕士学位期间取得的学术成果

附录

致谢

待发表文章一 类风湿关节炎患者血清中IL-21的含量及其临床意义

待发表文章二 IL-21与IL-21R在类风湿关节炎中的表达水平及其临床意义