补精解毒方组分对肺癌A549细胞核转录因子NF-KB、AP-1的影响

摘要

“精气亏虚、瘀毒内留”是肺癌的重要病机，补精解毒法是肺痛的重要治则。导师章永红教授根据补精解毒思想，结合多年临床经验创立了补精解毒方。前期研究证明补精解毒方具有较好的临床疗效以及较高的抗肿瘤活性。
　　 【目的】基于前期研究基础，研究补精解毒方组分（冬虫夏草苷、番荔枝苷）配伍对肺癌A549细胞核转录因子AP-1、NF-ΚB的影响。
　　 【方法】首先进行补精解毒方组分药物单体（冬虫夏草苷、番荔枝苷）的提取。四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)检测补精解毒方组分对肺癌A549细胞的抑制作用。AlinexinV-FITC染色流式细胞术、透射电镜观察补精解毒方组分对人肺癌A549细胞凋亡的作用。WesternBlot检测补精解毒方组分作用于肺癌A549细胞NF-ΚBP65蛋白表达。电泳迁移率变动(EMSA)检测补精解毒方组分作用于肺癌A549细胞的NF-ΚB、AP-1表达蛋白和DNA的结合活性。对肺癌A549细胞转染pNF-ΚB-1uc、pAP1-1uc报告基因质粒，补精解毒方组分作用后，微孔板发光仪检测荧光素酶值。激光共聚焦显微镜观察补精解毒方组分作用于肺癌A549细胞NF-ΚB的变化。
　　 【结果】从补精解毒方组分冬虫夏草和番荔枝中提取出单体成分：冬虫夏草苷、番荔枝苷，主要成分为分别为Cordycepin、Bullatacin。MTT法检测结果证实：冬虫夏草苷、番荔枝苷对肺癌A549细胞具有抑制作用，作用最佳时间为72h。IC50分别为40.369ug/ml、30.893ug/ml。
　　 补精解毒方组分作用于肺癌A549细胞后，AlinexinV-FITC染色流式细胞术检测总凋亡率分别为：补精解毒方59.2％、番荔枝53.2％、冬虫夏草31.1％。肺癌A549细胞在补精解毒方作用后，透射电镜下可以见到核变形、染色质凝聚、细胞器降解、线粒体肿胀、细胞质肿胀等典型的细胞凋亡现象。
　　 Western结果显示：补精解毒方组分作用于肺癌A549细胞后，NF-ΚBp65蛋白表达增高，阳性灰度积/内参值的阳性比分别为：补精解毒方0.862＞番荔枝苷0.656＞冬虫夏草苷0.574，均大于空白对照组0.411。
　　 EMSA结果表明：补精解毒方组分作用于肺癌A549细胞后，NF-ΚB、AP-1表达蛋白与DNA结合能力增强，各组NF-ΚB的阳性灰度积均值分别为番荔枝233571、冬虫夏草157870、补精解毒方242437.5，均大于空白组29897.5。各组AP-1的阳性灰度积均值分别为番荔枝355388、冬虫夏草244311、补精解毒方318776，均大于空白组84692.5。
　　 微孔板发光仪检测荧光素酶值结果显示：补精解毒方组分作用于肺癌A549细胞后NFΚB、AP-1荧光素酶值明显升高，与空白对照组比较具有明显差异(P＜0.01)。
　　 补精解毒方组分作用肺癌细胞A549后，激光共聚焦显微镜观察到细胞质内NF-ΚB增多，尤其是进入细胞核内的数量增多，提示活性增强。
　　 补精解毒方组分对肺癌细胞A549作用的强弱顺序为补精解毒方＞番荔枝＞冬虫夏草。
　　 【结论】1补精解毒方组分番荔枝苷和冬虫夏草苷对肺癌A549细胞具有诱导凋亡作用。
　　 2补精解毒方组分作用于肺癌A549细胞后NF-ΚB、AP-1活性增强、数量增多，此可能是补精解毒方诱导肺癌A549细胞凋亡的分子作用机制之一。