人参皂苷Rg3、索拉非尼、奥沙利铂単药及不同联合方式对肝癌Hedgehog信号通路影响的实验研究

摘要

目的:通过体外实验观察人参皂苷Rg3、索拉非尼、奥沙利铂单药及其不同联合方式对人肝癌Hep3B细胞增殖与凋亡的影响，并探索人参皂苷Rg3、索拉非尼、奥沙利铂单药及其不同联合方式对人肝癌Hep3B细胞和裸鼠人肝癌移植瘤组织中Hedgehog(Hh)信号通路的影响。检测各组中Hh通路上不同信号基因的表达，探讨药物作用机制，为今后相关药物联合使用或者开发Hh通路抑制剂与中药、化疗药、靶向药等的联合使用提供理论依据。
　　方法:首先观察药物对人肝癌Hep3B细胞生长的影响。选择不同浓度梯度的人参皂苷Rg3、索拉非尼、奥沙利铂单药作用于人肝癌Hep3B细胞，根据其不同时间增殖抑制情况选取其中合适的药物浓度，再将其以两药联合、三药联合方式分别作用于人肝癌Hep3B细胞，最终确定最佳浓度，主要实验方法有:(1) MTT法观察不同浓度各组药物对Hep3B细胞增殖的抑制情况;(2)流式细胞术观察各组中Hep3B细胞凋亡的情况。
　　其次，观察各组药物对Hep3B细胞以及前期实验提取的裸鼠人肝癌移植瘤组织中Hedgehog信号通路的影响，采用的方法有:(1)实时荧光定量PCR法（real-time PCR）检测各组Hep3B细胞中Smo、Shh、Gli1及Ptch1 mRNA的表达;(2)免疫印迹法(Westernblotting)检测各组Hep3B细胞和裸鼠人肝癌移植瘤组织中Smo、Shh、Gli1及Ptch1基因的表达。
　　结果:(1)人参皂苷Rg3、索拉非尼、奥沙利铂单药及其不同联合方式均能有效抑制Hep3B细胞的增殖,且这种抑制作用具有时间、剂量依赖性;其中两药联合优于单药，三药联合优于两药联合(P＜0.01)，药物之间主要表现为相加作用;(2)流式细胞术检测结果显示，各药物组均能够有效诱导Hep3B细胞凋亡，诱导凋亡作用两药联合组优于单药组，三药联合组优于两药联合组(P＜0.01);(3)实时荧光定量PCR法检测发现:除奥沙利铂单药组外，其余各组均能显著降低人肝癌Hep3B细胞中Ptch1、Smo、Shh mRNA表达水平(P＜0.01);所有用药组Gli1 mRNA表达水平均明显降低(P＜0.01);两药联合组与单药组比较Ptch1、Smo、Gli1、Shh mRNA表达水平有下降趋势，但大多数无统计学差异（P＞0.05）;三药联合组Ptch1、Smo、Gli1、Shh mRNA表达水平显著低于单药及两药联合组(P＜0.01)（个别两药组除外）。(4) Western blotting法检测人肝癌细胞中各信号蛋白表达结果显示:在正常生长的HepG2细胞中Gli1、Ptch1蛋白的表达明显低于Hep3B细胞(P＜0.01)，而Smo、Shh蛋白表达则无统计学差异(P＞0.05)。在各用药组Hep3B细胞中，奥沙利铂单药组能显著降低Smo、Gli1蛋白表达(P＜0.01)，而对Ptch1、Shh表达无影响(P＞0.05)，其余各用药组均能显著降低Ptch1、Smo、Gli1及Shh蛋白表达(P＜0.01)。两药联合组Ptch1、Smo、Gli1及Shh蛋白表达总体趋势较单药组低，其大部分无统计学差异（P＞0.05）。三药联合组Ptch1、Smo、Gli1及Shh蛋白表达较单药及两药组显著降低(P＜0.01)（个别两药组除外）。(5) Western blotting法检测裸鼠肝癌组织中各蛋白表达结果显示:除奥沙利铂单药组外，其余各用药组的组织中Ptch1、Smo、Gli1、Shh蛋白表达水平均显著低于对照组(P＜0.01或P＜0.05)，奥沙利铂单药组对组织中Ptch1、Smo、Gli1、Shh蛋白表达无明显影响(P＞0.05);部分两药组Ptch1、Smo、Gli1、Shh蛋白表达低于单药组(P＜0.01或P＜0.05)，三药组低于两药组(P＜0.01或P＜0.05)。
　　结论:人参皂苷Rg3、索拉非尼、奥沙利铂单药或两药、三药不同联合方式均能有效抑制人肝癌Hep3B细胞的增殖以及诱导其凋亡，且两药优于单药，三药优于两药。其作用机制可能与药物作用后能下调肝癌细胞Hedgehog信号通路中Ptch1、Smo、Gli1、Shh表达有关，尤以人参皂苷Rg3和索拉非尼为著，且两药联合下调肝癌细胞Hedgehog信号通路作用与单药差异不明显，三药联合下调作用明显优于两药和单药，这为临床寻找有效的药物联合方式提供了实验依据。

目录

声明

摘要

前言

第一部分 Hedgehog信号通路及其在肝癌中的研究进展

1 Hedgehog信号通路概述

1．1 Hedgehog信号通路的组成

1．2 Hedgehog信号传导的模式

2 Hedgehog信号通路与肿瘤

2．1 Hedgehog通路与肿瘤发生发展的关系

2．2 Hedgehog通路与多种常见肿瘤的关系

2．3 以Hedgehog通路活性作为靶标的抑癌药物

3 Hedgehog信号通路与肝癌

3．1 Hedgehog信号通路相关基因在肝癌发生发展中的表达

3．2 Hedgehog通路与肝癌的治疗与预后

4 部分抗癌药物对Hedgehog通路的影响

5 结语

第二部分 人参皂苷Rg3、索拉非尼、奥沙利铂单药及其不同联合方式对肝癌Hedgehog通路影响的实验研究

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

1．3 统计学方法

2 实验结果

2．1 MTT法观察药物作用后Hep3B细胞增殖抑制情况

2．2 流式细胞术检测药物作用后各组中Hep3B细胞凋亡情况

2．3 实时荧光定量PCR法检测药物作用后Hep3B细胞Smo、Shh、Gli1及Ptch1 mRNA的表达情况

2．4 Western blotting法检测药物作用后Hep3B细胞Smo、Shh、Gli1及Ptch1蛋白的表达情况

2．5 Western blotting法检测药物作用后裸鼠人肝癌移植瘤组织中Smo、Shh、Gli1及Ptch1蛋白的表达情况

第三部分 讨论

第四部分 结论

附图

参考文献

发表论文

缩略名词中英文对照表

攻读硕士学位期间取得的学术成果

致谢