基于“组分结构”特征的参芍舒胸方制剂设计前“芎芍”组分ADME/Eff性质研究

摘要

中药制剂不同于传统化学药物制剂，其制剂前处理过程是影响中药成药性及药效的关键因素，“中药物质基础—整体药效—组分结构—制剂前性质”内在存在特殊关联，实现中药组分（有限“N”个代表性成分）的化学成分普适性，确定思路及建立中药组分ADME/Eff性质表征方法，中药制剂前处理中对组分结构优化以及组分ADME/Eff性质表征对于中药组分制剂的发展有着至关重要的作用。中药“药对”在中医辨证施治的过程中具有优化药物组合的功效，能起到协同药效，并相互纠正其偏性，缓和其毒性达到相辅相成的效果，药对介于中药复方与单味药之间，是独具特色的中医临床用药，在中医方剂配伍中占有重要地位。中药功效物质基础组成是个复杂的整体，其内在的化学成分/组分之间存在的独特“结构”特征，这种组成结构特征的差别是造成药效差异的根本原因。“药对”的巧妙配伍，改变了物质基础组成结构，纠正其偏性。物质基础结构必然对药物体内的生物药剂学过程产生影响。因此，阐明组分结构改变对药效以及药动学的改变的影响，是科学阐述“药对”用药科学内涵的前提，也为创新组分结构中药的研发提供科学依据。
　　赤芍和川芎为临床常用的活血化瘀药，但目前对赤芍和川芎药对配伍的深入研究比较少，药对的配伍究其本质实际是组分间结构的改变。“组分结构理论”认为，中药（复方）及药材的物质基础即由不同组分构成按一定的量比关系（结构）组成，稳定的组分结构决定着疗效的可重复性。本课题基于中医药“药对”理论及物质基础“组分结构理论”，通过对药对协同作用的验证，结合体外Caco-2模型及入血成分辨识快速筛选出“川芎-赤芍”药对中的主要作用组分，并对其组分结构进行优化，研究其优化前后药效与ADME/Eff过程的变化，为阐明药对的科学内涵提供新的思路和方法，也将推动中药制剂前处理研究的进展，从而为中药组分制剂的研究提供理论依据。主要内容包括以下几个部分:
　　1.组分结构理论下芎芍药对抗缺血制剂合理性考察
　　本部分内容采用大鼠线栓法制备大脑中动脉梗塞(MCAO)模型，研究川芎、赤芍及其药对对缺血性大鼠脑组织的保护作用，并进一步探讨其可能作用机制。结果显示，相比单独使用川芎或赤芍药味，芎芍药对保护脑缺血损伤的功效更强，即可显著减轻脑缺血大鼠神经功能缺损、减少脑梗死面积;改善氧化指标:升高SOD、CAT，降低MDA含量、LPO活性;升高血浆PA含量，降低PAI-1含量，提高VEGF、GRP78表达，降低p-p38MPAK、TLR-4、 TLR-5、NFkBp65、PERK、XBP-1、CHOP、Caspase-3和Caspase-12表达;增加海马神经元相关蛋白Akt、P-CREB表达，抑制神经细胞调亡，保护血脑屏障，降低ERK蛋白的磷酸化程度，下调TLR4、p-p38和NF-kBp65蛋白;降低NMDAR1 mRNA表达及增加VEGF mRNA的表达;降低了伊文氏蓝(EB)的含量，改善血脑屏障通透性。这部分结果表明芎芍药对对脑缺血大鼠的治疗效果明显优于单独使用，提示芎芍药对具有功效协同作用，也证明芎芍抗脑缺血制剂生产的合理性。
　　2.制剂基本单元的组分/成分的表征、辨析
　　在前部分药效评估基础上，需要进一步揭示药对配伍后入血成分。本部分内容利用Caco-2单层模型对芎芍药对肠吸收的活性及机制进行研究，为其体内过程的研究提供基础。川芎、赤芍提取液以药对形式合用时，能促进赤芍总苷组分的单层渗透，同时提高其透过率。LC/ESI/MS/MS技术寻找、辨别和归属穿透Caco-2活性成分，综合分析化合物的保留时间、相对分子质量、碎片离子信息，鉴定出8个主要成分，分别为原儿茶酸、氧化芍药苷、儿茶素、芍药内酯苷、咖啡酸、芍药苷、阿魏酸、苯甲酰芍药苷。血清化学结合UPLC/Q-TOF-MS对芎芍药对入血成分进行鉴定，以明确其进入血液发挥药效作用的组分，赤芍中四个苷类成分:氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷、苯甲酰芍药苷;川芎中四个酚酸类成分:原儿茶酸、儿茶素、咖啡酸、阿魏酸。本部分研究初步认定赤芍总苷和川芎总酚酸为芎芍药对的抗脑缺血的活性组分。
　　3.川芎、赤芍中抗脑缺血组分制备及结构优化
　　赤芍总苷和川芎总酚酸为入血组分，但其发挥功效的最佳量比关系是如何的呢？本部分研究首先制备获得组分:通过对赤芍总苷、川芎总酚酸组分共同采取现代分离、分析技术，进行分离富集，获得组分。采用正交设计选出最佳提取工艺，比较5种大孔树脂的吸附、解吸附性能，筛选出D101型大孔树脂用于赤芍总苷分离纯化，AB-8型大孔树脂用于川芎总酚酸分离纯化。最终获得的赤芍总苷和川芎总酚酸的含量分别为47.92％、41.43％。其次，采用脑微血管内皮细胞OGD模型对川芎总酚酸组分和赤芍总苷组分不同组分间结构的体外抗脑缺血活性进行优化筛选，通过相关生化因子的测定，结果表明，芎芍组分结构在7∶3时，减轻氧化损伤(SOD、MDA、NO和NOS)的能力最强，降低炎症因子TNF-α、IL-6、sICAM-1表达最明显。最后，应用大鼠脑缺血模型对体外模型筛选出的芎芍组分最佳结构进行药效验证。与芎芍组分结构未进行优化相比，芎芍7∶3组分结构比例对大鼠神经功能缺损的保护效果最佳，能明显降低脑缺血大鼠脑梗死面积，抗自由基氧化，显著降低MMP-9表达，升高血浆PA含量，降低PAI-1含量。保护大鼠脑内血脑屏障，通过TEM、WB、Q-PCR、TUNEL等技术检查脑缺血大鼠脑内细胞的凋亡情况，结果表明，芎芍7∶3组分结构组对脑细胞抗凋亡能力最强。本部分研究表明，芎芍组分结构为7∶3时，其对脑缺血的治疗效果最优。
　　4.芎芍组分结构优化前后生物利用度、肠吸收转运及组分脑组织分布评价
　　最优的组分结构是否能提高组分/成分的体内生物利用度呢？本部分开展该项研究。借助HPLC/MS/MS技术分析比较大鼠灌胃赤芍总苷组分、川芎总酚酸组分、芎芍组分结构为7∶3时在大鼠体内原儿茶酸、儿茶素、阿魏酸、咖啡酸、芍药内酯苷、芍药苷、氧化芍药苷、苯甲酰芍药苷的药动学特征，并进行整合药代动力学的分析，从而研究组分结构优化前后组分内代表成分的药代动力学特征，重点比较了Cmax、 t1/2以及AUC0～∞，结果表明与结构优化前相比，芎芍7∶3组分结构中组分的生物利用度得到了提高，其半衰期也显著延长，证明芎芍组分结构优化后，提高了组分的生物利用度，促进了吸收，药效也相应提高。这也为组分优化前后药效学的差异性提出了很好的解释。组分结构优化后，芍药苷从A侧到B侧的转运量明显增加，其吸收系数PA-B也显著提高至原来的1.5倍，分泌渗透系数PB-A也有所提高，但是并没有显著性差异，芎芍组分进行组分结构优化后，川芎总酚酸组分的存在能够促进芍药苷的肠道吸收。组分结构优化后阿魏酸从A侧到B侧的转运量明显增加，其吸收系数PA-B也显著提高，表观渗透率（外排率）由0.86降低至0.68，芎芍组分进行组分结构优化后，赤芍总苷组分能够促进阿魏酸在肠道吸收。结果表明芎芍组分结构优化后对赤芍总苷和川芎总酚酸的转运均有一定的促进作用。脑部具有独特的生理结构，这些组分的协同作用是否与成分入脑性质改变相关呢？本部分还以超高效液相色谱对芎芍组分结构优化前后组分脑组织分布情况进行探索，发现脑部组分含量及微，因此拟采用微透析技术对芎芍组分大鼠脑部含量进行深入研究。
　　5.总结
　　本研究基于中医药“药对”理论及物质基础“组分结构理论”，通过对川芎-赤芍药对中抗脑缺血组分间结构进行优化，并进行优化前后药效及体内过程的比较研究，表明了芎芍组分结构优化后对脑缺血大鼠的治疗效果和体内ADME/Eff过程的促进作用，为组分创新中药的研制提供了理论基础。

目录

声明

论文说明

摘要

第一章 绪论

1．1 基于组分结构特征的现代中药制剂新思路

1．1．1 以药物前处理为特点的中药制剂发展

1．1．2 以整体层面为认知的中药物质基础研究

1．1．3 以药效专属性、贡献度为参考的中药组分筛选

1．1．4 以组分特性为依据的多元释药系统构建

1．1．5 以权重系数整合的组分制剂ADME／T／Eff性质考察

1．2 结构性的多组分／多成分药代动力学对中药制剂前后体内过程的影响

1．2．1 传统中药(复方)药代动力学研究方法回顾

1．2．2 现今中药药代动力学研究模式存在问题思考

1．2．3 组分结构思想下中药药代动力学模型的建立

1．3 脑缺血的研究进展

1．3．1 药物干预、改善脑缺血机制

1．3．2 组分结构理论下对中药防治脑缺血的重新认识

1．3．3 其他物理疗法对脑缺血的治疗

1．4 中药复方制剂“参芍舒胸方”研究背景及川芎-赤芍制剂设计前防治心脑血管疾病的组分结构特征探索

1．4．1 “参芍舒胸方”研究背景

1．4．2 川芎-赤芍药对物质基础组分结构特征解析

1．4．3．基于组分结构对川芎-赤芍药对制剂设计前后药效学研究

1．4．4．川芎-赤芍组分结构改变及体内动力学研究

参考文献

第二章 川芎-赤芍抗脑缺血制剂的合理性验证

2．1 线栓法大鼠脑缺血模型

2．1．1 仪器及试剂

2．1．2 动物

2．1．3 造模方法

2．2 制剂前处理中芎芍配伍配比对脑缺血后大鼠神经功能缺损评分的影响

2．2．1 分组及给药

2．2．2 统计学分析

2．2．3 结果

2．3 制剂前处理中芎芍配伍配比对脑缺血大鼠血清影响

2．3．1 对脑缺血大鼠血清抗自由基氧化影响

2．3．2 对脑缺血后大鼠血清MMP-9、PA、PAI-1的影响

2．4 制剂前处理中芎芍配伍配比对脑缺血后大鼠脑组织的影响

2．4．1 对脑缺血后大鼠脑梗死面积比的影响

2．4．2 对脑缺血后大鼠脑组织病理改变的影响

2．4．3 对脑缺血后大鼠脑组织免疫组化影响结果

2．4．3 蛋白免疫印迹法检测对脑缺血大鼠脑内蛋白表达的影响

2．4．4 RT-PCR法检测对大鼠脑组织海马细胞中NMDAR1和皮层细胞中VEGF表达的影响

2．4．5 实时定量荧光PCR检测大鼠脑组织海马细胞中NMDAR1和皮层细胞中VEGF含量

2．4．6 对脑缺血大鼠脑内血脑屏障通透性的影响

2．5 本章小结

参考文献

第三章 芎芍组分制剂基本单元的表征、辨析

3．1 芎芍药对穿透Caco-2细胞的活性评价

3．1．1 芎芍药对单层透过Caco-2给药浓度的确定

3．1．2 芎芍药对Caco-2细胞单层渗透实验

3．1．3 LC／ESI／MS／MS辨别穿透Caco-2活性成分

3．2 UPLC／Q-TOF-MS对芎芍药对入血成分的分析鉴定

3．2．1 UPLC检测芎芍药对入血成分

3．2．2 芎芍药对入血成分前处理因素的考察

3．2．3 UPLC／Q-TOF-MS解析芎芍药对入血成分

3．3 本章小结

参考文献

第四章 芎芍抗脑缺血组分的制备及组分结构优化

4．1 芎芍组分的制备

4．1．1 赤芍总苷组分的分离富集纯化研究

4．1．2 川芎总酚酸组分的分离富集纯化研究

4．2 川芎总酚酸和赤芍总苷组分结构的优化

4．2．1 芎芍组分对HBMEC的体外毒性实验

4．2．2 HBMEC缺糖、缺氧损伤模型的建立

4．2．3 HBMEC的OGD模型筛选芎芍组分最优结构

4．3 体内脑缺血模型对芎芍优化组分的验证

4．3．1 模型制备及分组给药

4．3．2 芎芍组分对脑缺血后大鼠神经功能缺损评分的影响

4．3．3 芎芍药对对脑缺血后大鼠脑梗死面积比的影响

4．3．4 芎芍组分对脑缺血大鼠抗自由基氧化检测结果

4．3．5 芎芍组分对脑缺血大鼠血清MMP-9、PA、PAI-1的影响

4．3．6 芎芍组分对对脑缺血后大鼠脑组织病理改变的影响(HE)

4．3．7 电镜超微组织观察观察芎芍组分对脑缺血后大鼠海马区细胞形态的影响

4．3．8 芎芍组分对对脑缺血大鼠脑内血脑屏障的保护作用

4．3．9 芎芍组分对脑缺血大鼠脑内相关蛋白表达的影响

4．3．10 实时定量荧光PCR(Real-Time PCR)检测芎芍组分对脑缺血大鼠脑组织抗凋亡作用

4．3．11 TUNEL法检测迷芎芍对芎芍组分对脑缺血大鼠脑组织细胞凋亡的影响

4．4 本章小结

参考文献

第五章 芎芍组分组成结构对其药代动力学、肠吸收转运和脑组织分布的影响

5．1 大鼠血浆中芎芍组分的HPLC／MS／MS分析方法的建立

5．1．1 材料

5．1．2 实验方法和结果

5．2 芎芍组分单独给药大鼠体内药动学研究

5．2．1 赤芍总苷组分大鼠体内药动学研究

5．2．2 川芎总酚酸组分大鼠体内药动学研究

5．3 芎芍组分7∶3结构给药大鼠体内药动学研究

5．3．1 材料

5．3．2 实验方法

5．3．3 统计分析

5．3．4 实验结果

5．4 芎芍组分结构优化后对阿魏酸和芍药苷在Caco-2细胞模型中吸收转运的影响

5．4．1 MTT法考察芎芍组分对Caco-2细胞的毒性

5．4．2 组分的细胞转运实验

5．5 组分结构优化对抗脑缺血组分大鼠脑组织分布的影响

5．5．1 材料

5．5．2 实验方法

5．5．3 实验结果

5．6 本章小结

参考文献

第六章 总结与展望

6．1 研究创新点

6．2 主要结论

6．3 工作展望

附录

攻读硕士学位期间取得的学术成果

致谢