吴茱萸碱联合常用化疗药物奥沙利铂等对消化道肿瘤细胞的作用及机制探讨

摘要

目的:
　　研究中药单体吴茱萸碱（Evodiamine，Evo）联合常用化疗药物奥沙利铂(Oxaliplatin，Oxa)及5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil，5-Fu)对常见消化道肿瘤细胞，人肠癌细胞株SW480、人胃癌细胞株SGC-7901以及人食管癌细胞株TE1的体外相互作用及其可能作用机制。
　　方法:
　　1)采用MTT法分别检测Evo、Oxa、5-Fu不同浓度各单药作用于指数增殖期的人肠癌细胞株SW480、人胃癌细胞株SGC-7901以及人食管癌细胞株TE1，由此确定各个单药的IC50;
　　2)根据各单药的IC50，确定Evo与Oxa，Evo与5-Fu，两药联合作用时的药物浓度梯度，并采用MTT法再次分别检测Evo联合Oxa、5-Fu作用于上述三株不同种类的肿瘤细胞的细胞毒效应;
　　3)运用中效原理(Median-effect Principle)，分别绘制出各单药、两药联合用药对三株肿瘤细胞的增殖抑制曲线，以及联合用药对不同肿瘤细胞的合用指数曲线，以此来判定联合用药的两药之间的相互作用关系;
　　4)采用流式细胞术(FCM)分析在不同药物浓度下合用产生协同效应的两药对细胞凋亡及细胞周期的影响。
　　结果:
　　1)人肠癌细胞株SW480:Evo、Oxa和5-Fu对于指数增殖期的SW480细胞均有增殖抑制作用，药物作用48小时后的IC50分别为:Evo:(10.295±0.568)μg/ml，Oxa:(9.438±1.750)μg/ml，5-Fu:(6.8754±2.733)μg/ml。利用中效原理分析，Evo联合Oxa时，在较低浓度(Fa＜0.65)时，两药合用效应表现为协同;Evo联合5-Fu时，在Fa＜0.75时，两药合用效应表现为协同。
　　2)人胃癌细胞株SGC-7901:Evo、Oxa和5-Fu对于对指数增殖期的SGC-7901细胞均有增殖抑制作用，作用48小时后的IC50分别为:Evo:(9.114±1.261)μg/ml，Oxa:(9.895±0.432)μg/ml，5-Fu:(15.149±2.903)μg/ml。利用中效原理分析，;Evo联合Oxa，在较低浓度(Fa＜0.45)时，两药合用效应表现为协同;Evo联合5-Fu时，在较大浓度时(Fa＞0.45)，两药合用效应为协同。
　　3)人食管癌细胞株TE1:Evo、Oxa和5-Fu对于指数增殖期的TE1细胞均有增殖抑制作用，作用48小时后的IC50分别为:Evo:(6.935±0.698)μg/ml，Oxa:(21.679±7.201)μg/ml，5-Fu:(25.840±6.422)μg/ml。利用中效原理分析，Evo联合Oxa时，无论是在较大浓度，亦是在较低浓度，两药联合作用时合用效应均为协同;Evo联合5-Fu时，在Fa＜0.80时，两药合用效应为协同。
　　4)流式细胞仪(FCM)分析细胞凋亡:在单药低细胞毒剂量IC25左右浓度，即Evo:4μg/ml、Oxa:10μg/ml、Evo+Oxa:(4+10)μg/ml左右浓度，作用于TE1细胞48 h后，联合用药组与对照组、单药组相比总凋亡率显著升高（联合用药组凋亡率为45.7％），并以晚期凋亡为主(41.1％)。
　　5)流式细胞仪(FCM)分析细胞周期:在单药低细胞毒剂量IC25左右浓度，即Evo:4μg/ml、Oxa:10μg/ml、Evo+Oxa:(4+10)μg/ml左右浓度，作用于TE1细胞48 h后，Evo组(54.25％)较对照组(27.54％) G0/G1期细胞比例升高，联合Oxa作用后G0/G1期细胞比例进一步升高(71.30％)。
　　结论:
　　1) Evo对SW480、SGC-7901及TE1细胞均有抑制增殖的作用，相同药物浓度情况下，食管癌TE1细胞对Evo最敏感。
　　2) Evo联合Oxa、5-Fu作用于SW480细胞，在一定浓度下具有协同作用，其产生协同作用的浓度是:Evo＜(7.328±0.905)μg/ml、Oxa＜(9.160±1.132)μg/ml和Evo＜(21.033±2.308)μg/ml、5-Fu＜(442.010±229.117)μg/ml。
　　3) Evo联合Oxa作用于SGC-7901细胞，在较低浓度下具有协同作用，其产生协同作用的浓度是:Evo＜(7.892±1.295)μg/ml、Oxa＜(8.686±0.462)μg/ml; Evo联合5-Fu作用于SGC-7901细胞，在较高浓度下具有协同作用，其产生协同作用的浓度是:Evo＞(7.892±1.295)μg/ml、5-Fu＞(7.631±1.598)μg/ml。
　　4) Evo联合Oxa作用于TE1细胞，无论在低浓度或是在较高浓度均产生协同作用;Evo联合5-Fu作用于TE1细胞，在一定浓度作用下产生协同作用，其产生协同作用的浓度是:Evo＜(16.939±1.292)μg/ml、5-Fu＜(5678.333±6957.135)μg/ml。
　　5) Evo联合Oxa作用于TE1细胞产生协同效应的机制可能是:①诱导TE1细胞凋亡，尤其是晚期凋亡;②将TE-1细胞周期阻滞在G0/G1期。

目录

声明

摘要

第一部分 理论研究

1 中药发挥抗肿瘤作用的机制研究与展望

1．1 直接抑制肿瘤细胞的生长与增殖

1．2 诱导肿瘤细胞凋亡

1．3 影响肿瘤细胞周期

1．4 逆转肿瘤细胞的多药耐药性

1．5 抗肿瘤血管生成

1．6 增强机体的免疫力

1．7 展望

2 与某些化疗药物产生协同作用的相关中药研究进展

2．1 姜黄素

2．2 藤黄酸

2．3 汉防己甲素

2．4 苦参碱

2．5 丹皮酚

2．6 黄芪多糖

2．7 人参皂苷

2．8 其他中药有效成分

第二部分 应用中效原理评价吴茱萸碱与常用化疗药物对肿瘤细胞的作用

1 实验主要材料

1．1 实验药物

1．2 肿瘤细胞株

1．3 主要试剂

1．4 主要仪器和设备

2 实验方法

2．1 实验分组

2．2 MTT法测定药物效应

2．3 药物浓度的选择

2．4 利用中效原理评价药物联合应用效应

2．5 利用统计学方法

3 实验结果

3．1 各单药对三株消化道肿瘤细胞株增殖抑制的影响

3．2 两药联合效应分析

4 讨论

第三部分 吴茱萸碱联合奥沙利铂对食管癌TE1细胞凋亡和细胞周期的影响

1 实验材料

1．1 实验药物

1．2 肿瘤细胞株

1．3 主要试剂

1．4 主要仪器和设备

2 实验方法

2．1 药物浓度的选择

2．2 实验步骤

3 实验结果

3．1 细胞凋亡实验结果

3．2 细胞周期实验结果

4 讨论

第四部分 实验总结

参考文献

第五部分 文献综述 吴茱萸碱诱导肿瘤细胞凋亡的分子机制研究进展

攻读硕士学位期间取得的学术成果

致谢