葛根总黄酮体外诱导NB4细胞凋亡分子机制

摘要

目的：
　　葛根总黄酮(puerariae radix flavones，PRF)是葛根的主要活性成分。近5年，课题组发现0～50μg/mlPRF呈浓度、时间依赖性诱导急性早幼粒细胞白血病细胞株NB4细胞凋亡，并使NB4细胞周期进程阻滞于S期。此外，PRF诱导NB4细胞凋亡中，JNK蛋白被激活，磷酸化水平上调;ERK表达上调;p38表达下调;caspase3剪切体表达增多。本研究在前期研究基础上采用JNK抑制剂SP600125、p38抑制剂SB203580、ERK抑制剂U0126、caspase抑制剂Z-VAD-FMK分别阻断JNK、p38、ERK、caspase信号通路，检测0～50μg/mlPRF对NB4的增殖抑制作用及相关凋亡信号分子的变化，进一步探讨PRF诱导NB4细胞凋亡的分子机制。
　　方法：
　　1.0、10、30、50μg/ml PRF±10μmol/L SP600125、10μmol/L SB203580、10μmol/LU0126、20μmol/L Z-VAD-FMK作用于NB4细胞24、48及72小时，MTT法检测NB4细胞的增殖抑制率。
　　2.10μg/ml PRF±10μmol/L SP600125干预NB4细胞24、48、72小时后，蛋白印迹法检测凋亡相关蛋白表达。
　　3.0、10、30、50μg/ml PRF±10μmol/L SP600125干预NB4细胞48小时，蛋白印迹法检测凋亡相关蛋白表达。
　　4.0、10、30、50μg/ml PRF±20μmol/L Z-VAD-FMK干预NB4细胞48小时，蛋白印迹法检测凋亡相关蛋白表达。
　　5.30μg/mlPRF±SP600125、SB203580、U0126、Z-VAD-FMK干预NB4细胞48小时，蛋白印迹法检测凋亡相关蛋白表达。
　　6.30μg/mlPRF干预NB4细胞0小时、12小时、24小时、36小时、48小时后，蛋白印迹法检测凋亡相关蛋白表达。
　　结果：
　　1.10μg/mlPRF联合SP600125对NB4细胞的增殖抑制率较单药组明显增强;30μg/mlPRF联合SP600125组对NB4的增殖抑制率明显高于PRF单药组，但随着PRF作用时间延长，差异逐渐缩小，干预72小时，联合组与单药组无明显差异;50μg/mlPRF联合SP600125组和单药组对NB4细胞的增殖抑制率无明显差异。
　　2.PRF对NB4细胞的增殖抑制作用被Z-VAD-FMK抑制，随着PRF作用时间延长，联合组和单药组的差异逐渐增大。
　　3.SB203580、U0126不明显影响PRF对NB4细胞的增殖抑制率。PRF联合SB203580/U0126组和单药组的增殖抑制率无差异。
　　4.10μg/mlPRF处理NB4细胞24、48、72小时后JNK、caspase3、Bcl-2、p-bcl-2表达上调，JNK呈时间依赖性上调，caspase3和Bcl-2、p-bcl-2在48小时表达最高;联合SP600125后，p-bcl-2表达上调，干预24小时，JNK、caspase3、bcl2蛋白较单药组表达增加，干预48、72小时，JNK、caspase3、bcl2较单药组表达降低。
　　5.0-50μg/mlPRF干预NB4细胞48小时，JNK蛋白表达水平呈浓度依赖性上调，caspase3表达水平上调，Bcl-2表达水平下调，CDK2-cyclinA表达上调，p53表达无明显变化;Z-VAD-FMK预处理NB4细胞2小时，JNK表达水平上调，caspase3，p53表达水平下调，bcl-2表达较单药组轻度上调，CDK2、cyclinA表达水平都较单药组上调;SP600125预处理NB4细胞，JNK、caspase3表达水平较单药组下调;ERK表达受抑，Bcl-2表达上调。
　　6.30μg/mlPRF处理NB4细胞48小时，caspase3、JNK、ERK、p53表达上调，Bax表达下调;联合p38抑制剂组较之单用药物组可见JNK、caspase3、Bax、p53和ERK表达均上调;联合JNK抑制剂组、ERK抑制剂组和caspas抑制剂组较之单药组JNK、ERK、p53、caspase3表达下调，Bax表达上调;
　　7.30μg/mlPRF处理NB4细胞不同时间，随着作用时间的延长，JNK表达水平逐渐增加，仅在24小时轻度下调;p38表达下调;ERK表达水平在12小时上调，之后逐渐下调;caspase3表达水平明显上调;CDK2表达水平上调，12小时达高峰;p53表达水平无明显变化
　　结论：
　　结合课题组前期研究结果，本研究认为PRF诱导NB4细胞凋亡的分子机制可能根据PRF浓度和处理时间有所不同，虽然10、30、50μg/ml PRF都能激活JNK通路，但激活的JNK通路可能既参与细胞凋亡程序的激活也活化细胞生存信号。低浓度PRF或者短时间处理可能一过性激活JNK，生存信号占优势，促进细胞增殖，但是否诱导细胞分化成熟还需进一步证明;提高PRF浓度或延迟处理时间导致JNK持续活化，凋亡信号占优，激活凋亡程序。凋亡过程中，p38、ERK通路都与JNK通路发生联系，共同调节细胞凋亡的发生，但p38、ERK并不是PRF诱导NB4细胞凋亡中不可或缺的信号分子。此外，本研究还进一步证实了PRF引起NB4细胞周期阻滞的分子机制，主要与cyclinA-CDK2的异常表达有关。CyclinA-CDK2表达水平上调，加速细胞进入S期，导致DNA复制紊乱，促进凋亡发生。

目录

声明

摘要

前言

第一部分 理论研究

1 中医对急性白血病的认识

1．1 中医对“血液”、“血液病”及“急性白血病”认识

1．2 急性白血病的病因病机

1．3 急性白血病的中医治疗

2 急性早幼粒细胞白血病治疗进展

2．1 对疑似APL患者的初始治疗

2．2 APL分化综合征

2．3 诱导治疗

2．4 三氧化二砷的应用

2．5 巩固治疗

2．6 维持治疗

2．7 评估疗效和监控

2．8 复发APL患者的治疗策略

3 细胞凋亡程序在抗肿瘤治疗中的应用

3．1 凋亡程序概述

3．2 靶点1——死亡受体通路

3．3 靶点2——线粒体凋亡途径

第二部分 实验研究

1 实验目的

2实验材料与方法

2．1 主要仪器设备

2．2 主要材料和试剂

2．3 蛋白印迹法(Western blot)相关试剂

2．4 细胞模型的建立

3 实验方法

3．1 MTT检测细胞增殖抑制率

3．2 Western blot法检测PRF±抑制剂处理NB4细胞后凋亡相关蛋白表达

3．3 统计学数据处理

4 实验结果

4．1 PRF±SP600125对NB4细胞株增殖抑制的检测

4．2 PRF±p38抑制剂SB203580对NB4细胞株增殖抑制的检测

4．3 PRF±ERK抑制剂U0126对NB4细胞株增殖抑制的检测

4．4 PRF±caspase抑制剂Z-VAD-FMK对NB4细胞株增殖抑制的检测

4．5 PRF±caspase抑制剂Z-VAD-FMK影响NB4细胞凋亡相关蛋白的表达

4．6 PRF±JNK抑制剂SP600125影响NB4细胞凋亡相关蛋白的表达

4．7 10μg/mlPRF联合或不联合JNK抑制剂作用不同时间后对NB4相关蛋白表达的影响

4．8 30μg/mlPRF联合不同抑制剂作用48小时后对NB4相关蛋白表达的影响

4．9 30μg/mlPRF作用不同时间后对NB4相关蛋白表达的影响

5 小结

5．1 SP600125预处理PRF干预NB4细胞的增殖抑制作用

5．2 Z-VAD-FMK预处理后PRF对NB4细胞的增殖抑制作用

5．3 SB203580、U0126预处理后PRF对NB4细胞的增殖抑制作用

5．4 PRF±caspase抑制剂Z-VAD-FMK、JNK抑制剂SP600125影响NB4细胞凋亡相关蛋白的表达

5．5 10μg/mlPRF联合或不联合JNK抑制剂作用不同时间后对NB4相关蛋白表达的影响

5．6 30μg/mlPRF联合不同抑制剂作用48小时后对NB4相关蛋白表达的影响

5．7 30μg/mlPRF作用0、12、24、36、48小时后对NB4细胞的凋亡相关蛋白表达的影响

第三部分 讨论

参考文献

附录

攻读硕士学位期间取得的研究成果

致谢