基于HGF/c-MET通路探讨消瘤胶囊对肝癌细胞SMMC7721的抑制作用及机制

摘要

当前研究已经证实，在诸多不同组织的癌症中都有发现肝细胞生长因子(HGF)及其受体的表达，HGF与c-Met结合，活化HGF/c-Met信号转导通路，从而诱导细胞的增殖，迁移，抗凋亡等作用。相关实验表明，HGF/c-Met途径可以旁路激活VEGF信号通路，从而增加肿瘤细胞的微血管密度(MVD)。消瘤胶囊是江苏省首届国医名师、江苏省名中西医结合专家徐荷芬教授根据“祛邪不伤正”原则创制的院内制剂，已在临床运用30余年，前期动物实验研究表明，消瘤胶囊低、高剂量组均可显著降低肿瘤大鼠的MVD（微血管密度）（与模型组比较，P＜0.05，P＜0.01），其中高剂量组的MVD与阳性组接近[1]。为此，我们就消瘤胶囊是否通过HGF/c-Met途径发挥抑制肿瘤增殖和迁移的作用进行探讨。
　　目的:
　　观察消瘤胶囊对肝癌细胞系及裸鼠肝癌移植瘤的疗效及其起效机理是否通过HGF/c-Met通路发挥进行初步探讨。
　　方法:
　　流式细胞术观察消瘤胶囊对HGF刺激后的肝癌细胞SMMC7721凋亡的促进作用。并将SMMC7721细胞种植于裸鼠右侧皮肤下，给药后定期测量并评价消瘤胶囊对裸鼠移植瘤增殖的限制作用。Transwell法检测消瘤胶囊对SMMC7721迁移的抑制作用。TUNEL法检测裸鼠移植瘤的凋亡情况，并运用免疫组化检测裸鼠移植瘤内c-Met的表达情况及消瘤胶囊灌胃后的影响，ELISA法对裸鼠血清HGF的表达进行检测，Western blot法检测SMMC7721内Met、p-Met、Erk、p-Erk、Akt、p-Akt的表达情况。
　　结果:
　　流式细胞术结果显示消瘤胶囊低剂量组(5mg/ml)、中剂量组(15mg/ml)、高剂量组(25mg/ml)对肝癌细胞的凋亡作用伴随药物浓度的增加和给药时间的延长，凋亡趋势逐渐增强，Transwell结果显示:消瘤胶囊各剂量组对SMMC7721细胞的迁移均有抑制作用，与对照组相比p＜0.05。TUNEL结果表明:消瘤胶囊对裸鼠移植瘤具有促进凋亡的作用，免疫组化结果表明，消瘤胶囊对c-Met的表达并无影响，各组之间无明显差异(p＞0.05)，ELISA结果显示:消瘤胶囊高剂量组呈现出较强的抑制HGF分泌的作用，随着药物浓度的递减，HGF的表达逐渐升高。Western blot法检测结果显示，消瘤胶囊可以抑制HGF/c-Met的磷酸化，其下游的p-Erk、p-Akt逐渐减弱。
　　结论:
　　消瘤胶囊能够促进肝癌细胞SMMC7721凋亡，限制其迁移能力;其作用机制是减少HGF的表达，降低HGF/c-Met磷酸化通路活化而发挥作用。

目录

声明

摘要

前言

第一部分 理论研究

1 现代医学对原发性肝癌的认识

1．1 肝癌的病因

1．2 肝癌的主要治疗方法

1．3 与肝癌相关的主要信号通路和肝癌的靶向治疗

1．4 HGF／c-Mct信号通路和肝癌

2 祖国医学对肝癌的认识

2．1 祖国传统医学中肝癌的病因病机概括

2．2 肝癌的辨证论治

3．消瘤胶囊与肝癌

第二部分 实验研究

1 实验目的

2 实验材料

2．1 细胞系

2．2 实验动物

2．3 主要试剂与药品

2．4 主要仪器设备

3 实验方法

3．1 细胞培养

3．2 分组

3．3 肝癌皮下种植裸鼠模型建立后的分组和给药方法

3．4 肝癌细胞凋亡试验

3．5 Western-blot检测c-Met相关蛋白

3．6 transwell法检测消瘤胶囊对肝癌细胞迁移的抑制作用

4 统计方法

5 实验结果

5．1 流式细胞术评价消瘤胶囊对SMMC7721体外凋亡的促进作用

5．2 transwell法检测消瘤胶囊对肝癌细胞体外迁移的抑制作用

5．3 消瘤胶囊各剂量组对裸鼠移植瘤体积的影响

5．4 TUNEL染色法观察消瘤胶囊对裸鼠种植瘤细胞凋亡的影响

5．5 免疫组化观察消瘤胶囊对裸鼠移植瘤中c-Met的表达的影响

5．6 ELISA法检测消瘤胶囊对裸鼠血清中HGF的表达的影响

5．7 Western-blot检测在经HGF刺激后c-Met下游相关通路的激活

6 讨论

6．1 消瘤胶囊诱导HGF刺激的SMMC7721细胞体外凋亡的作用

6．2 消瘤胶囊对HGF刺激后的SMMC7721迁移的体外抑制作用的影响

6．3 消瘤胶囊对c-Met在肝癌细胞中表达情况的影响

6．4 消瘤胶囊对HGF在裸鼠肝癌中的表达的影响

6．5 消瘤胶囊对HGF／c-Met信号通路及其下游通路的活化的抑制作用

7 结语

参考文献

文献综述 原发性肝癌的治疗进展

附录

攻读硕士学位期间取得的学术成果

致谢