基于内质网应激与Wnt/β-catenin信号通路研究蛇床子素对成骨细胞增殖与分化的影响及机制

摘要

背景:骨质疏松症是由体内骨吸收-骨形成耦联失衡引起的代谢性骨病，其治疗着眼于恢复骨代谢平衡。蛇床子素被证实具有抗骨质疏松的药理作用，但其抗骨质疏松的机制尚不清楚。
　　目的:观察蛇床子素对大鼠成骨细胞增殖与分化的影响，探讨蛇床子素抗骨质疏松的机制。
　　方法:通过改良酶消化法及反复贴壁纯化法从新生大鼠颅骨中获取原代成骨细胞;通过光镜下形态观察、碱性磷酸酶染色、茜素红法矿化结节染色等方式鉴定成骨细胞。采用CCK-8法筛选出10-6M、10-5M、10-4M作为低、中、高浓度蛇床子素组，以10-8Mβ-雌二醇作为阳性对照组，0.25％DMSO作为溶剂对照组，最后设立空白组排除DMSO对成骨细胞的干扰。本研究采用CCK-8法测定成骨细胞增殖能力、偶氮偶联法测定细胞内碱性磷酸酶表达、茜素红染色法测定成骨细胞矿化能力以及酶联免疫法测定骨钙素分泌量，从不同角度、不同阶段检测蛇床子素对成骨细胞分化的影响。并通过检测内质网应激标志分子GRP78、PDI、CHOP以及Wnt/β-catenin信号通路的Wnt、β-catenin蛋白的表达来分析蛇床子素影响成骨细胞增殖和分化的机制。
　　结果:10-4M的蛇床子素可以抑制成骨细胞增殖，10-5M的蛇床子素在给药72h后也会抑制成骨细胞增殖;10-4M的蛇床子素可以促进成骨细胞表达，10-5M蛇床子素组在给药48h后成骨细胞内碱性磷酸酶也开始提高;各浓度蛇床子素均可以促进成骨细胞骨钙素的分泌和矿化结节形成，其中10-4M的蛇床子素效果最强;各浓度蛇床素均可以降低GRP78表达，尤以10-4M浓度最为显著，而PDI的表达与蛇床子素的浓度呈正相关，其中10-4M浓度蛇床子素可以增加PDI表达，CHOP的表达只在10-4M浓度组检测到;Wnt1蛋白在10-4M及10-5M组表达增加，而β-catenin只有10-4M组升高。
　　结论:蛇床子素可通过提高Wnt1蛋白水平来促进β-catenin介导的成骨细胞增殖与分化，但是高浓度蛇床子素过强的促分化能力会通过内质网应激途径造成成骨细胞凋亡，从而大大抑制成骨细胞增殖，蛇床子素刺激成骨的最佳浓度在5×10-5M～10-4M之间。本研究证实了蛇床子素促进骨形成的作用并提出其作用机制，为后续以蛇床子素为有效成分的新药研发提供了研究基础。

目录

声明

摘要

绪论

第一部分 成骨细胞增殖与分化的调控机制及实验研究进展

1 中药及其有效成分调控成骨细胞增殖与分化的实验研究进展

2 蛇床子素对成骨细胞增殖与分化的影响及机制研究进展

3 成骨细胞增殖与分化的调控机制研究

第二部分 成骨细胞的原代分离、培养及鉴定

1 实验材料

2 成骨细胞的体外分离及原代培养

3 成骨细胞传代培养

4 成骨细胞的鉴定

5 结果

第三部分 蛇床子素对成骨细胞增殖与分化的影响

1 实验材料

2 实验分组

3 CCK-8法测定成骨细胞增殖

4 偶氮偶联法定量检测ALP

5 酶联免疫(ELISA)法测定骨钙素

6 茜素红法矿化结节染色

7 结果

8 讨论

第四部分 蛇床子素影响成骨细胞增殖与分化的机制研究

1 实验材料

2 实验分组

3 蛋白质免疫印迹(Westem Blot)法测定内质网应激与Wnt／β-catenin信号通路蛋白表达

4 结果

5 讨论

结语

1 总结

2 创新点

3 不足与展望

参考文献

附录

攻读硕士学位期间取得的学术成果

致谢