Ala-Gln对断奶仔猪体液免疫及肠黏膜细胞免疫的调控作用

摘要

本研究以21日龄早期断奶仔猪为试验对象，研究了Ala-Gln对仔猪体液免疫及肠黏膜细胞免疫的调节作用，并以仔猪小肠上皮细胞(IPEC-1)为模型探讨了Ala-Gln对仔猪小肠上皮细胞增殖与凋亡的调控机制。
　　试验一:Ala-Gln对断奶仔猪外周血细胞因子、免疫器官细胞因子及T淋巴细胞亚群的调节作用
　　本试验采用单因子试验设计，选用遗传背景和体重相近（6.7±0.9kg）、21±2日龄断奶的长白×大白去势仔猪100头，按完全随机区组设计分为4处理，每个处理设5个重复，每个重复5头仔猪。各处理仔猪饲粮为在基础饲粮基础上分别添加0％、0.15％、0.30％和0.45％Ala-Gln。试验期为21d。于试验第7、14、21d从每个重复随机选取1头接近平均体重的仔猪进行前腔静脉采血并屠宰。采集外周血液及免疫器官用于测定细胞因子含量和外周T淋巴细胞亚群分布表达以探讨Ala-Gln对断奶仔猪体液免疫的影响。结果显示，(1)饲粮中添加0.15％、0.30％Ala-Gln提高了仔猪断奶后第7d血液中ALB、TP、免疫球蛋白IgA、IgG的含量(P＜0.05)，降低了COR的含量(P＜0.05);0.30％Ala-Gln组仔猪在断奶后第14d TP、IgA、IgG含量也显著高于对照组（P＜0.05），COR的含量则低于对照组(P＜0.05);(2)饲粮中添加不同水平的Ala-Gln均可显著降低血清中细胞因子IL-6水平(P＜0.05);断奶后第7、14d，0.30％Ala-Gln显著提高了仔猪IL-2、TNF-α水平，0.15％Ala-Gln显著降低IL-5的水平(P＜0.05);在断奶后第21d，IL-5水平随Ala-Gln添加量呈二次曲线变化规律，0.45％Ala-Gln组IL-5显著高于对照组(P＜0.05)。此外，0.30％Ala-Gln使仔猪脾脏、胸腺中IL-10水平大幅提高(P＜0.05)，而各Ala-Gln添加组脾脏、胸腺中的TNF-α水平显著低于对照组(P＜0.05)。(3)Ala-Gln可在一定程度上增加外周血T淋巴细胞亚群CD4+表达并降低CD8+的表达。各试验处理组仔猪在断奶后第7dCD4+/CD8+比值显著高于对照组(P＜0.05)。0.45％Ala-Gln在断奶后第14、21天显著提高仔猪CD4+/CD8+比值(P＜0.05)。由此可知，Ala-Gln可提高仔猪血液中免疫球蛋白、抗炎因子的水平同时降低炎性因子的水平，增强仔猪的免疫功能，进而缓解早期断奶应激。
　　试验二:Ala-Gln对断奶仔猪小肠黏膜固有层SIgA浆细胞数量、SIgA及黏膜中细胞因子的含量的影响
　　试验设计同试验一。于试验第7、14、21d，从每个重复选取1头接近平均体重的仔猪屠宰。采集小肠肠段、小肠黏膜以分析小肠黏膜固有层SIgA浆细胞表达及 SIgA、黏膜中细胞因子的含量。结果显示，(1)饲粮中添加0.15％～0.45％Ala-Gln均显著提高仔猪断奶后第7、14、21d十二指肠以及空肠黏膜固有层SIgA浆细胞数量(P＜0.05)，尤其是0.30％Ala-Gln组仔猪在断奶第14d空肠SIgA浆细胞数比对照组增加22.6％(P＜0.05)。在回肠段，0.30％Ala-Gln显著提高断奶后第7、14d仔猪SIgA细胞数(P＜0.05)。(2)断奶仔猪空肠黏膜SIgA含量随着Ala-Gln添加量呈二次曲线增长规律。在断奶后第7天，0.30％Ala-Gln组仔猪SIgA含量与对照组相比极显著提高了70.4％(P＜0.01)。在断奶后第14、21天，0.15％Ala-Gln和0.30％Ala-Gln显著提高了SIgA的分泌量(P＜0.05)。(3)饲粮中Ala-Gln添加0.15％和0.30％可显著性提高仔猪早期断奶后第7天黏膜细胞因子IL-2、IL-5的水平（P＜0.05）;随着日粮中Ala-Gln添加量的增加，各组IL-6的含量呈线性增长趋势，且显著高于对照组(P＜0.05)。黏膜TNF-α含量在试验第7、21d随Ala-Gln添加呈线性降低变化，以0.30％和0.45％添加组最低(P＜0.05)。由此说明，饲粮中添加适量Ala-Gln可提高肠黏膜固有层SIgA浆细胞数量，黏膜SIgA分泌量及IL-2、IL-6含量，降低TNF-α水平，增强黏膜免疫应答，提高断奶仔猪肠道黏膜细胞免疫。
　　试验三:Ala-Gln对仔猪小肠上皮细胞凋亡的影响
　　本试验以仔猪小肠上皮细胞(IPEC-1)为体外细胞模型，在营养性缺乏Gln条件下体外培养IPEC-1细胞以模拟断奶应激。经含0、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0mM Ala-Gln的培养基处理IPEC-1后，用流式细胞仪分析测定IPEC-1的凋亡率，采用Western Blot方法检测Caspase-3激活产物和抑制凋亡蛋白Bcl-2的表达量，以探讨Ala-Gln对仔猪小肠上皮细胞凋亡的影响及其作用机理。结果显示，(1)各Ala-Gln处理组中IPEC-1细胞凋亡率均显著低于对照组(P＜0.05)。随着Ala-Gln添加量的增加，IPEC-1细胞凋亡率表现为先降低后增加的规律，当Ala-Gln的浓度为1.0mM和2.0mM时，IPEC-1细胞凋亡率最低，显著低于对照组(P＜0.05)，但两处理组之间差异不显著(P＞0.05)。(2)经Western Blot未检测到Caspase-3激活产物和Bcl-2的表达。

目录

论文说明

声明

摘要

缩写词表(Abbreviations)

第一章 文献综述

1 研究的目的与意义

2 国内外研究现状

2．1 仔猪的免疫机制

2．2 早期断奶对仔猪免疫机能的影响

2．3 Gln及其二肽对断奶仔猪免疫机能影响的研究进展

3 技术路线

第二章 试验研究

试验一 Ala-Gln对断奶仔猪外周血细胞因子、免疫器官细胞因子及T淋巴细胞亚群的调节作用

1 材料与方法

2 数据处理与统计分析

3 结果与分析

4 讨论

试验二 Ala-Gln对断奶仔猪小肠黏膜固有层SIgA浆细胞数量、SIgA及黏膜中细胞因子含量的影响

1 材料与方法

2 数据处理与统计分析

3 结果与分析

4 讨论

试验三 Ala-Gln对仔猪小肠上皮细胞凋亡的影响

1 材料与方法

2 数据处理与统计分析

3 结果与分析

4 讨论

第三章 本研究的总体结论、创新点及有待进一步解决的问题

1 总体结论

2 创新点

3 有待进一步解决的问题

参考文献

致谢

附图