毛花猕猴桃果实抗坏血酸合成酶相关基因的克隆及定量表达分析

摘要

以毛花猕猴桃（Actinidia eriantha）‘赣猕6号’品种为试材，对其果实发育期间抗坏血酸（AsA）含量及其合成相关酶GalLDH与APX含量的动态变化进行了测定分析。采用改良氯化锂沉淀法从果实中提取RNA，克隆得到了AsA合成酶GalUR、GME和GMP基因的cDNA全长序列和GPP基因的cDNA序列片段。利用qPCR技术对供试品种果实发育过程中AsA合成相关酶基因GME、GMP、GalUR、GPP、GalLDH、GalDH和GGP的表达特征进行了分析，研究结果可为解析毛花猕猴桃果实AsA富集的分子机制提供理论依据。主要研究结果如下：
　　1.对毛花猕猴桃‘赣猕6号’整个发育期间果实AsA水平的动态变化进行了测定与分析，AsA含量在果实发育前期快速积累，盛花后53d(Days After Full Blossom,DAFB)达到最高值（22.43mg/g），DAFB112d时AsA含量不断下降至7.65mg/g，此后AsA的形成和降解达到平衡，积累量基本不变，成熟期的AsA含量稳定在6.56mg/g。GalLDH酶活性在果实发育至成熟的过程中始终保持较高的水平，在DAFB53d时活性最强，达到1.95U/g FW。毛花猕猴桃果实发育后期APX酶活性较高，果实成熟期APX酶活性最强(1.957U/g FW)。
　　2.GalUR、GME与GMP基因的cDNA与其他植物中的该基因分别都有较高的同源性。测序结果表明克隆得到的GalUR基因cDNA全长为1031bp，共编码322个氨基酸。该基因与美味猕猴桃（ADB85571.1）中的GalUR1同源性为95％。AsA合成酶GME基因序列长为1139bp，编码376个氨基酸，与美味猕猴桃（Actinidia deliciosa）及山梨猕猴桃（Actinidia rufa）的GME氨基酸同源性均为98%；GMP序列长为1392bp，编码361个氨基酸，与阔叶猕猴桃GMP基因氨基酸同源性达97%。
　　3.利用qPCR技术对毛花猕猴桃‘赣猕6号’果实发育过程中AsA合成相关酶基因GMP、GME、GGP、GPP、GalDH、GalLDH和GalUR的表达进行了分析。GalUR基因在果实发育过程中的相对表达量前期先上升后期逐渐下降，与AsA含量变化趋势一致，表明D-半乳糖醛酸途径可能存在于毛花猕猴桃的AsA合成中。GME与GMP基因的相对表达量在前期DAFB34d至DAFB53d内剧烈上升，随后逐渐降低。GPP、GalDH、GalLDH基因表达量的趋势类似，在发育起始期（DAFB34d）的表达量最大，随后缓慢下降。GPP表达量呈现逐渐下降的变化趋势，最高点出现在DAFB53d，而果实发育期间DAFB95d时表达量最低。L-半乳糖途径中的酶基因的表达为该途径存在于毛花猕猴桃的AsA合成中亦提供了依据。GME基因在全过程中表达量高于其他基因3-5倍，可以推测L-古洛糖途径在毛花猕猴桃的AsA的合成中也起到作用。

目录

声明

第一章 文献综述

1.1 AsA的生物学功能

1.2 AsA的生物合成途径及代谢

1.3 AsA合成酶相关基因的研究进展

1.4果树AsA相关研究进展

1.5毛花猕猴桃AsA相关研究进展

1.6本论文研究的目的与意义

第二章材料与方法

2.1材料

2.2方法

第三章结果与分析

3.1毛花猕猴桃果实RNA的提取

3.2 GalUR基因的克隆

3.3 GME基因的克隆

3.4 GMP基因的克隆

3.5 GPP基因片段的克隆

3.6毛花猕猴桃发育过程中AsA含量及相关酶活性的变化

3.7毛花猕猴桃发育过程中AsA相关合成酶基因的定量表达

4.1关于毛花猕猴桃RNA的提取

4.2 GalUR、GME和GMP基因克隆的意义

4.3毛花猕猴桃AsA合成相关酶基因定量表达

第五章结 论

参考文献

缩略词表

致谢

作者简历