人工合成甘蓝型油菜异源多倍体化诱发的四个开花基因结构变异的特征分析

摘要

在人工合成多倍体中基因组或表型不稳定是多倍体高效育种的一个重要限制因素。多倍体化过程中经常会出现序列消除或新序列的产生。而以往检测到的变异序列多为重复序列或随机序列，并未涉及到完整的基因序列。我们前期研究发现，在二倍体甘蓝和白菜种间杂交及染色体加倍而形成的人工合成甘蓝型油菜中，有四个DNA片段发生了变异，并且分别与四个开花基因（LHP1，CRY1，TOE2和GAI）高度同源。
　　本研究以人工合成异源四倍体甘蓝型油菜不同世代(F1-F4)材料为研究对象，测序和克隆发生变异的四个开花基因全长基因序列和cDNA序列，分析异源多倍体化诱导的基因变异特征和不同世代中基因的时空表达规律。本研究有利于阐明多倍体化诱导的基因变异对多倍体产生的作用，同时为多倍体育种提供理论指导。研究的主要结果如下：
　　1.为了筛选基因变异株系及克隆基因，我们通过序列比对，对基因分段设计引物。四个基因中有15对引物能够在F1-F4群体中扩增出31条清晰的多态性带型，其中有13条为新带型，其中LHP1有7条，CRY1有1条，TOE2有4条，GAI有1条。统计发现，四个基因的变异分布在57个人工合成甘蓝型油菜株系中，说明大部分株系都有可能在某些位点发生变异。LHP1, CRY1, TOE2和GAI产生变异的单株分别为29个、3个、49个和12个。本实验证实了，将基因切割成适当长度的小片段，分别设计引物，然后在不同的材料中进行PCR扩增，能够成为开发一种新的基于基因的功能型分子标记。
　　2.根据BRAD数据库上公布的油菜四个开花基因的序列。采用primer premier5软件设计引物，利用RT-PCR技术从甘蓝型油菜的叶片中分别克隆到了四个开花基因的全长CDS。并将四个基因的全长CDS连接在pGEM-T克隆载体上并测序。找出了存在片段差异的株系。
　　3.通过测序比对及核苷酸多态性分析可知。CRY1基因全长为2522bp，总共检测到20个SNP及2个InDel，有3个SNP突变位点发生在外显子上，SNP突变未改变氨基酸序列。GAI基因全长为423bp，总共有4个SNP及1个InDel，变异均在外显子上，突变改变了氨基酸序列及数目。LHP1基因全长为1842bp，总共发现8个SNP及2个InDel，外显子上的SNP突变位点有2个，SNP突变改变了氨基酸序列。TOE2基因全长为2005bp，检测到6个SNP位点及3个InDel，外显子上有4个SNP突变及1个InDel，SNP及InDel改变了氨基酸序列及数量。CRY1、GAI、LHP1和TOE2的核苷酸多态性(Pi)分别为：0.00793,0.00946,0.00434和0.00301。另外，对四个变异及野生型基因进行了GO功能比较分析。结果表明：CRY1及TOE2的分子功能未发生改变；而突变型GAI参与的生物过程与野生型存在差异，未被注释能参与调控氮素利用率及韧皮部的运输；LHP1的分子功能也发生了变化，与野生型相比，突变型LHP1还参与通过RNA的基因沉默，初级代谢过程，细胞大分子代谢过程及单细胞器生物体组织等生物过程。
　　4.将存在差异的四个开花基因的全长CDS连接在pGEM-T克隆载体上并测序。含CRY1的重组质粒用BamHI、XbaI双酶切并与经BamHI、XbaI双酶切的表达载体pBI121S连接后转化大肠杆菌DH5ɑ，获得PBI121S-CRY1和anti-PBI121S-CRY1表达载体。含TOE2、LHP1、GAI的重组质粒分别用BamHI、KpnI双酶切并与经BamHI、KpnI双酶切的表达载体 pBI121S连接后转化大肠杆菌 DH5ɑ，获得PBI121S-TOE2, anti-PBI121S-TOE2, PBI121S-LHP1, anti-PBI121S-LHP1, PBI121S-GAI, anti-PBI121S-GAI表达载体。
　　5.采用冻融法将构建的四个开花基因的正反义植物表达载体转化到农杆菌EHA105中，对转化菌液进行PCR扩增，证实表达载体已转入农杆菌。含有载体的农杆菌用于基因功能验证。本实验通过克隆四个开花基因并对基因变异序列进行分析，构建植物表达载体为遗传验证实验做准备。

目录

英文缩写表

第一章 文献综述

1.1甘蓝型油菜简介

1.2四个开花基因研究进展

1.3多倍体研究现状和分析

1.4研究意义

第二章 四个开花基因变异模式分析及变异序列克隆

2.1材料与试剂

2.2实验方法

2.3结果与分析

第三章 甘蓝型油菜四个开花基因cDNA的克隆及分析

3.1材料与试剂

3.2实验方法

3.3结果与分析

第四章 甘蓝型油菜四个开花基因植物表达载体的构建

4.1材料与试剂

4.2实验方法

4.3结果与分析

第五章 结论与讨论

5.1关于四个开花基因的克隆

5.2四个开花基因变异模式及特征分析

5.3四个开花基因的生物信息学分析

5.4构建植物表达载体的影响因素

参考文献

附录

致谢