甘蓝型油菜菌核病抗性相关基因BnPTP1与控制开花时间相关基因BnVRN2的功能研究

摘要

油菜是世界四大油料作物之一，菜油是国产食用植物油的第一大来源。然而核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)引起的油菜菌核病严重制约着我国油菜产业的发展。利用油菜抗病品种是菌核病综合防治的基础，培育更抗品种是育种的主要目标之一。然而，在油菜育种中发现菌核病的发生和开花时间具有一定的关联:开花较早的品种，菌核病病害更加严重，这给目前正在实施的早熟育种增加了困难。为了提高油菜育种效率，需要阐明油菜菌核病抗性与开花时间之间是否具有遗传关系。本实验室前期以甘蓝型油菜888-5（感病、早花、矮秆、多分枝）和M083（抗病、晚花、高秆、少分枝）杂交形成的重组自交系(RILs)群体为材料，利用油菜60K SNP芯片（Illumina Inc，San Diego，CA）对群体进行基因型分型，通过多年多点的表型鉴定，进行了全基因组的QTL定位，获得了一些与抗菌核病及开花相关的QTL区间。在这些区间预测到若干候选基因。在此基础上，本研究挑选出两个候选基因BnPTP1和BnVRN2，进行功能研究，包括BnPTP1和BnVRN2及其所属基因家族的生物信息分析，在抗、感品系间的差异分析，突变体和过表达研究。主要结果如下:
　　1.对BnPTP1的研究
　　1.1 BnPTP1及其所属基因家族的生物信息分析
　　对BnP TP1的蛋白结构分析发现它属于酪氨酸磷酸酶(PTP)家族。利用拟南芥及芸薹属白菜、甘蓝和甘蓝型油菜的基因组数据，对PTP家族进行鉴定和进化分析。结果表明，四个物种中共有19个PTP基因家族成员，可以分为2类，这些基因启动子区域富含ABRE、LTRE、MYB、MYC和W-box等顺式作用元件，这些顺式作用元件跟抗逆抗病应答相关，因此，PTP家族的基因可能参与植物的逆境胁迫应答反应。
　　1.2 BnPTP1在抗、感亲本中的差异分析
　　以甘蓝型油菜M083（抗病、晚花）和888-5（感病、早花）品系为材料对BnPTP1基因进行克隆;对两个品系中BnPTP1序列差异及核盘菌诱导前后的表达水平差异进行分析研究。结果显示在甘蓝型油菜中BnPTP1基因存在两个拷贝，分别命名为BnPTP1a（位于C6染色体）、BnPTP1b（位于A7染色体）。BnPTP1a在抗、感品系中存在序列差异，而BnPTP1b则不存在。BnPTP1a在M083和888-5中的CDS全长分别为1014bp、1017 bp，分别编码337、338个氨基酸;两个品系中BnPTP1a基因的CDS序列存在着29个SNP变异位点以及一个3bp的插入/缺失片段(其中M083第604位(G)对应的888-5第607位(T)的核苷酸变异类型与前期的SNP分型结果一致）;核苷酸序列的差异导致了两条序列产生了3个各自特异的酶切位点（SpeⅠ、BsmBⅠ、Psp1406Ⅰ和DrdⅠ、EcoRⅠ、BsaⅠ），此外蛋白质序列也产生了11个氨基酸的改变，且这些变异的氨基酸都包含在两者的PTPc结构域中。BnPTP1a基因在菌核病诱导前后，在M083和888-5中的表达水平都存在差异，因此BnPTP1a参与了菌核病防御反应过程。同时进行了各自的过表达载体的构建，并成功的筛选到了拟南芥转基因阳性植株。
　　1.3 ptp1突变体菌核病抗性鉴定
　　由于PTP家族的基因启动子区域富含胁迫应答相关顺式作用元件，我们进一步调查了野生型拟南芥和ptp1突变体对菌核病的抗性。结果表明，ptp1突变体的病斑面积表显著小于WT，即AtPTP1负调控植株对菌核病的抗性。此外，分析了ptP1突变体和WT中SA、JA和ROS/PCD信号途径PR1、PDF1.2、MPK4、MPK6这几个关键基因的表达水平变化，发现AtPTP1基因可能通过抑制SA、JA防御途径中下游PR1、PDF1.2、MPK4基因的表达而对SA、JA途径进行负调控;AtPTP1基因对ROS/PCD途径中的MPK6基因的作用不明显，这可能跟突变体在接种核盘菌后产生了大量的活性氧相关。
　　2.对Bn VRN2的研究
　　2.1 BnVRN2及其所属基因家族的生物信息分析
　　对BnVRN2蛋白结构分析发现它属于VEFS家族。利用拟南芥及芸薹属白菜、甘蓝和甘蓝型油菜的基因组数据，对VEFS家族进行鉴定和进化分析。结果表明，四个物种中共有32个PTP基因家族成员，可以分为2类，这些基因启动子区域富含ABRE、LTRE、MYB、MYC和W-box等抗逆抗病应答相关顺式作用元件，因此，VRN2基因不仅参与开花调控也可能参与植物的逆境胁迫应答反应。
　　2.2 Bn VRN2在抗、感亲本中的差异分析
　　在拟南芥中，VRN2(VERNALIZATION PESSPONSE2)是春化作用相关的基因。以M083和888-5为材料对BnVRN2基因进行克隆;对两个品系中BnVRN2序列差异及核盘菌诱导前后的表达水平差异进行研究。结果显示在甘蓝型油菜中BnVRN2基因存在两个拷贝，分别命名为BnVRN2a(位于A8染色体)、BnVRN2b(位于C8染色体)，BnVRN2a在抗、感品系中存在序列差异，而BnVRN2b则不存在。BnVRN2a在M083和888-5中的CDS全长分别为1278bp、1284 bp，分别编码425、427个氨基酸;两个品系中BnVRN2a基因的CDS序列存在着12个SNP变异位点以及一个6bp的插入/缺失片段(其中M083第258位(G)对应的888-5第258位(T)的核苷酸变异类型与前期的SNP分型结果一致）;核苷酸序列的差异导致了两条序列产生了各自特异的酶切位点(XmnⅠ和BspHⅠ);此外蛋白质序列也产生了7个氨基酸的改变，且第100位氨基酸变异存在于两者的锌指结构中。BnVRN2a基因在菌核病诱导前后，在M083和888-5中的表达水平都存在差异，初步推测该基因在甘蓝型油菜开花相关途径和菌核病防御反应中都可能起到一定的作用。

目录

声明

摘要

英文缩略表

第一章 引言

1．1 菌核病研究进展

1．1．1 油菜菌核病的危害

1．1．2 油菜菌核病的症状

1．1．3 油菜菌核病病原的生物学特性

1．1．4 油菜菌核病的侵染循环

1．1．5 病原致病过程及机理

1．1．6 植物防卫反应机制

1．1．7 油菜菌核病的抗性QTL定位

1．2 植物开花期研究进展

1．2．1 拟南芥开花时间调控网络

1．2．2 油菜开花期相关QTL定位研究

1．3 油菜菌核病抗性与开花期的关系

1．4 PTP家族及PTP1基因研究进展

1．5 VEFS家族及VRN2基因研究进展

1．6 本研究内容与目的意义

第二章 BnPTP1基因的功能研究

2．1 前言

2．2 材料

2．2．1 基因组数据

2．2．2 植物材料

2．2．3 菌株

2．2．4 实验试剂

2．2．5 溶液及培养基配制

2．3 方法

2．3．1 芸薹属AC基因组中PTP基因家族成员的鉴定与进化分析

2．3．2 油菜抗、感品系中BnPTP1基因的克隆及差异分析

2．3．3 BnPTP1基因在油菜抗、感品系中的过表达研究

2．3．4 拟南芥ptp1突变体菌核病抗性鉴定

2．4 结果与分析

2．4．1 芸薹属AC基因组中PTP基因家族成员的鉴定与进化分析

2．4．2 油菜抗、感品系中BnPTP1基因的克隆及差异分析

2．4．3 BnPTP1基因过表达转基因拟南芥的获得

2．4．4 拟南芥ptp1突变体菌核病抗性鉴定

2．5 讨论

第三章 BnVRN2基因的功能研究

3．1 前言

3．2 材料

3．3 方法

3．3．1 芸薹属AC基因组中VEFS基因家族成员的鉴定与进化分析

3．3．2 BnVRN2基因在油菜抗、感亲本中的克隆及差异分析

3．3．3 BnVRN2的过表达研究

3．4 结果与分析

3．4．1 芸薹属AC基因组中VEFS基因家族成员的鉴定与进化分析

3．4．2 BnVRN2在油菜抗、感亲本中的克隆及差异分析

3．5 讨论

第四章 全文结论

参考文献

致谢

作者简历