（一）hs TRAIL基因的克隆表达、载体选择及蛋白复性研究;（二）谷胱甘肽S-转移酶（GSTp）半胱氨酸的定点突变及其在293细胞中的功能研究

摘要

采用PCR技术从人肝脏cDNA文库扩增出编码114-281位氨基酸的TRAIL基因片段(hsTRAIL),将之克隆至原核表达载体pET30a、pET25b和pJLA503中,构建成重组载体pET30a/hsTRAIL、pET25b/hsTRAIL和pJLA503/hsTRAIL,以上重组载体诱导表达后,SDS-PAGE鉴定显示pET30a/hsTRAIL系统表达效率最高,目的蛋白占菌体总蛋白含量的40﹪左右;采用透析法或梯度稀释法对hsTRAIL包涵体蛋白进行复性,结果显示梯度稀释法明显好于透析法;纯化后的hsTRAIL蛋白具有明显的生物学活性,效果与标准品相似.利用PCR定点突变技术构建人GSTp三种半胱氨酸突变体C<'47/101>、C<'14/47/101>和C<'14/47/101/169>.将GSTp野生型和突变体表达质粒转染293细胞,以CDNB为底物测定胞内GST的转移酶活性,结果显示各类突变体均明显抑制了细胞内源性GST的催化活性,具有显著的负显性(dominant negative)突变体的功能;将GSTp野生型和突变体与c-Jun、NF-κ B和p53的报告基因载体共转染,通过萤光素酶活性测定发现突变体C<'14/47/101>和C<'14/47/101/169>能明显激活c-Jun和p21的转录活性;Western印迹分析显示突变体均能上调细胞内p21蛋白的水平,细胞存活率的测定表明GSTp突变体能增强293细胞对H<,2>O<,2>刺激的敏感性;实验结果表明半胱氨酸残基对于维持GSTp在对抗细胞氧化应激过程中的保护作用至关重要.

目录

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第一部分hsTRAIL基因的克隆表达、载体选择及蛋白复性研究

摘要

Abstract

文献综述

第一章可溶性TRAIL （hsTRAIL）/pET-3c原核表达载体的构建及诱导表达

前言

1.实验材料

2.实验方法

3.实验结果

4.讨论

第二章hsTRAIL三种不同表达载体的构建、选择和蛋白复性

前言

1.实验材料

2.实验方法

3.实验结果

4.讨论

第二部分 人谷胱甘肽S-转移酶（GSTp）半胱氨酸的定点突变及其在293细胞中的功能研究

摘要

Abstract

文献综述

第三章两种GSTp半胱氨酸突变体的构建

前言

1.实验材料

2.实验方法

3.实验结果

4.讨论

第四章GSTp及其三个半胱氨酸突变体的功能研究

前言

1.实验材料

2.实验方法

3.实验结果

4.讨论

参考文献

附录

致谢