薯蓣内生真菌生物活性及其与宿主细胞共培养的初步研究

摘要

植物内生真菌可产生多种生物活性物质且数量庞大，是一类具有潜在开发价值的微生物新资源。但至今，对内生真菌的研究既不深入也不系统，所研究的植物类群大约只有数百种，有待于进一步开发利用。薯蓣是重要的药用植物，利用薯蓣愈伤组织、细胞培养合成薯蓣皂甙元是解决野生薯蓣因过度采挖而面临枯竭的方法之一，但因其产量太低而至今未能实现工业化生产。根据近年来的研究成果，一般认为植物内生真菌与其宿主是协同进化的，作为内共生物可以产生与其宿主相同或相似的生理活性物质，因此，这为将薯蓣细胞与其内生真菌进行共培养，探索模拟二者的共生关系以促进薯蓣细胞合成薯蓣皂甙元提供了理论基础。本研究通过组织分离法从盾叶薯蓣(Dioscoreazingiberensis)的根茎、种子、叶和茎等部位分离了内生真菌并进行了形态鉴定，开展了薯蓣内生真菌抗氧化活性和抑菌活性等生物活性的初步研究和产黄酮类化合物及皂甙类化合物内生真菌的筛选。又以薯蓣茎段诱导了愈伤组织，进而建立了薯蓣悬浮细胞系，初步构建了薯蓣内生真菌与薯蓣悬浮细胞的共培养体系，比较了共培养体系、单独培养的薯蓣悬浮细胞系和薯蓣内生真菌中的皂甙元含量、抗氧化活性及抗氧化代表酶酶活性的差异。 从盾叶薯蓣(D.zingibernsis)各部位共分离到50株内生真菌，初步鉴定有19株分属于盐霉属(AspergillusMicheliexFr.)、须壳霉属(PyrenochaetadeNot)、刺孢壳属(ChaetomellaFuckel)、侧孢霉属(SporotrichumLk.exFr.)、棒束梗霉(IsariaPers.exFr.)、假黑粉霉属(ConiosporiumLk.exFr.)和简梗孢霉属(ChromosporiumCorda)，其余菌株因不产孢而暂未鉴定。将此50株薯蓣内生真菌分批接种至马铃薯葡萄糖液体培养基中于27℃、120r/min摇床中振荡培养7天，收获菌丝及发酵液。利用碘量法检测到4株菌株的菌丝及发酵液的乙醇提取物有抗氧化活性，其中分离于根茎的薯蓣内生真菌菌株EDT5和分离于种子的菌株EDS4的发酵液的乙醇提取物的抗氧化活性较高，且在一定范围内，随着其浓度的增加，抗氧化活性增强，表明这两个菌株具有用于天然抗氧化物质生产的潜在价值。利用生长速率法和孢子萌发法检测到分离于根茎的EDT3、EDT4、EDT5和分离于种子的EDS1、EDS3、EDS4等6株菌株的发酵液对棉花黄萎病菌(Verticilliumdahliae)等6种植物病原真菌的菌丝生长和孢子萌发有抑制作用，其中EDS3和EDS4两个菌株的发酵液的混和液对此6种植物病原真菌的菌丝生长和孢子萌发有更好的抑制作用。利用TLC、HPLC和显色反应等方法筛选到一株产黄酮类化合物的菌株EDS4及两株产皂甙类化合物的菌株EDS3和EDT5。EDS4菌株发酵液的乙醇提取物经HPLC检测有一个峰的保留时间(5.717)和芦丁标准品的保留时间(5.731)基本相同，其显色反应结果也与黄酮类化合物的特征性显色反应结果相一致，因此初步推测EDS4菌株发酵液的乙醇提取物中含有黄酮类化合物。EDS3和EDT5菌株菌丝提取物在薄层层析中的Rf值与薯蓣皂甙元标准品的Rf值相一致，显色反应结果也与皂甙类化合物的特征性显色反应结果相一致，因此初步推测EDS3和EDT5菌株菌丝提取物中含有皂甙类化合物。在薯蓣内生真菌和薯蓣悬浮细胞共培养的研究中，以薯蓣茎段诱导的愈伤组织色泽鲜嫩、质地疏松，培养30天后其薯蓣皂甙元含量为2.713μg/gdw；薯蓣悬浮细胞比较均一稳定，培养30天后其薯蓣皂甙元含量为1.732μg/gdw；将薯蓣悬浮细胞种子液接入新鲜培养液中振荡培养7天后接入EDT5菌丝得到了比较稳定的共培养体系，培养30天后其薯蓣皂甙元含量为2.167μg/gdw；同时，相对于单独培养的薯蓣悬浮细胞和薯蓣内生真菌EDT5，共培养体系细胞内的抗氧化酶活性较高，而其滤液中的抗氧化酶活性较低；碘量法实验表明共培养液的抗氧化活性高于薯蓣悬浮细胞液，表明决定抗氧化活性的不是抗氧化相关酶系，而是内生真菌产生的可分泌到细胞外的其它抗氧化活性物质。

目录

学位论文独创性声明及学位论文使用授权声明

摘要

一、综述

1药用植物内生真菌的研究

2薯蓣皂甙元的特性与功能

3盾叶薯蓣的资源分布、生物活性和组织培养

3.1资源分布

3.2药理研究

3.3化学成分

3.4愈伤组织和细胞培养

二、薯蓣内生真菌的分离与鉴定

1材料与方法

2结果与分析

3讨论

三、薯蓣内生真菌代谢产物活性的初步研究

(一)薯蓣内生真菌抗氧化活性的初步研究

1材料与方法

2结果与分析

3讨论

(二)薯蓣内生真菌发酵液抑制植物病原真菌的研究

1材料与方法

2结果与分析

3讨论

四、产生物活性物质薯蓣内生真菌的筛选

(一)产黄酮类化合物薯蓣内生真菌的筛选

1材料与方法

2结果与分析

3讨论

(二)产皂甙类物质薯蓣内生真菌的筛选

1材料与方法

2结果与分析

3讨论

五、内生真菌-薯蓣细胞共培养体系的建立

1材料与方法

1.1材料、试剂及仪器

1.2方法

2结果与分析

2.1愈伤组织与悬浮细胞的培养

2.2内生真菌与悬浮细胞共培养体系的构建

3讨论

六、内生真菌-薯蓣细胞共培养体系的生物活性检测

1材料与方法

2结果与分析

2.1共培养体系和愈伤组织中薯蓣皂甙元含量

2.2共培养前后培养液抗氧化活性的变化

2.3共培养前后培养体系抗氧化酶酶活性的变化

3讨论

小结

参考文献

致谢