针对c-Met的重组腺病毒介导的siRNA技术在肝癌基因治疗中的实验研究

摘要

本文针对c-Met的重组腺病毒介导的siRNA技术在肝癌基因治疗中的实验研究进行了探讨. 肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma，HCC)是我国最常见的恶性肿瘤之一，已成为我国第2位恶性肿瘤致死原因，临床上迫切需要新的治疗方法。随着人们对肝癌发病机制的深入认识和基因治疗技术的逐步成熟，肝癌的基因治疗已成为极有发展前景的治疗方法。 c-Met是肝细胞生长因子(HGF)受体，属Ⅱ型跨膜酪氨酸蛋白激酶受体，在多种肿瘤中过表达，且具有组成性活性，与肿瘤的发生和恶化密切相关。我们及其他学者的研究表明，c-Met在30-50％的肝癌病例中过表达。我们用免疫印迹实验检测5种不同肝癌细胞系(BEL7402，SMMC7721，HepG2，MHCC97-L和HCCLM3)和1种永生化的正常肝细胞系(LO2)，发现c-Met在MHCC97-L和HCCLM3细胞中表达量极高，是其它细胞系的7-8倍，且具组成性酪氨酸磷酸化。因而我们设想某些肝癌的发生与c-Met过表达相关，下调c-Met表达可能会抑制这些肝癌细胞的生长和浸润。 RNA干扰(RNAi)是最近几年发展起来的一门新兴的抑制基因表达技术。腺病毒载体因具有感染细胞种类多、感染效率高、外源基因表达水平高且既适于体外又适于体内研究等特点而被广泛用于基因治疗和临床试验中，本论文采用了腺病毒介导的RNAi技术来验证我们的设想。结果如下： 1．我们用细菌内同源重组的方法构建了针对c-Met的siRNA表达重组腺病毒AdHl-siRNA／met，RT-PCR和免疫印迹实验表明，AdHI-siRNA／met可特异性地使肝癌细胞c-Met表达量下降90％以上。 2．MTT法表明，AdHl-siRNA／met能显著抑制MHCC97-L和HCCLM3细胞的活力，感染第3天抑制率大于30％，但其对BEL7402，SMMC7721，HepG2细胞的生长抑制作用较小，感染第3天抑制率仅为8-10％，对LO2细胞的活力则没有明显影响。 3．细胞直接计数法显示，AdHl-siRNA／met可显著抑制MHCC97-L和}tCCLM3细胞增殖，感染后的第3天，与对照组相比，细胞增殖速率下降了30％左右；软琼脂克隆形成实验表明，AdH1-siRNA／met可使MHCC97-L和HCCLM3细胞克隆形成能力分别下降约70％和78％(P<0．01)；流式细胞术显示，AdH1-siRNA／met可使MHCC97-L细胞停留在Gl／GO期。 4．MHCC97-L细胞感染病毒24 h后接种于裸鼠腹股沟皮下，6周后，空白对照组和空载对照组的8只裸鼠全都长出了肿瘤，而实验组的8只裸鼠中仅有5只长出了肿瘤，而且长出的肿瘤明显比空白对照组和空载对照组裸鼠长出的肿瘤小。取下肿瘤，称重并作统计学分析后表明，实验组裸鼠肿瘤重量只有空载对照组的41％(P<0．01)。基因治疗实验显示腺病毒AdH1-siP(NA／met可显著抑制接种裸鼠的肝癌生长，在瘤内注射腺病毒6次后，抑制率达61％左右。 5．肝细胞生长因子(HGF)可通过降低E-cadherin的表达、促使β-catenin从细胞膜进入细胞质和细胞核，以及提高MMP2的活性等方式诱导HepG2细胞离散性生长，增强HepG2细胞的浸润能力。AdH1-siRNA／met可明显抑制HGF诱导HepG2细胞离散性生长和浸润能力。 我们的结果表明:重组腺病毒介导的siRNA技术在体外和体内能有效地下调肝癌细胞c-Met的表达。下调c-Met的表达可抑制c-Met过表达的肝癌细胞的生长和浸润。c-Met可作为肝癌病理诊断的一个标记分子和肝癌基因治疗的一个有效靶点。

目录

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英文缩写词表

第一章前言

第二章c-Met与Fas在肝癌组织和肝癌细胞系中的表达

第三章c-Met siRNA表达重组腺病毒载体的构建

第四章AdH1-siRNA/met对肝癌生长的影响

第五章AdH1-siRNA/met抑制HGF诱导的肝癌细胞离散与浸润

全文小结

附录

致谢