针对PTN重组慢病毒介导的siRNA技术在小细胞肺癌基因治疗中的实验研究

摘要

目的：构建针对多效蛋白（pleiotrophin，PTN）基因的小干涉RNA（siRNA）慢病毒表达载体并观察其对人小细胞肺癌H446细胞株PTN表达抑制及对细胞生长及凋亡的影响。同时观察PTN基因沉默后，人小细胞肺癌H446细胞中与血管新生、肿瘤生长、侵袭过程相关的血管内皮细胞生长因子（VEGF）、angiomotin（Amot）、schlafen5（Slfn5）和金属蛋白酶9（MMP-9）4种基因的表达变化。构建人小细胞肺癌H446细胞裸鼠异种移植瘤模型，观察PTN基因RNA干扰病毒对移植瘤瘤体生长的抑制作用。
　　 方法：利用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和Western blot方法检测PTN在H446细胞中的表达。设计四对针对PTN基因的小发夹RNA（shRNA）序列，与Plvthm载体连接，构建慢病毒表达载体LV（lentiviral）-shPTN，连接产物转化到DH5a感受态细胞，阳性克隆测序鉴定。再用LV-shPTN与pRsv-REV、pMDlg-pRRE、pMD2G三种质粒共转染293T细胞，小量包装与纯化产生慢病毒颗粒。病毒感染H446细胞后，用荧光定量PCR及Western blotting检测细胞中PTN基因的表达。选择对PTN基因干扰效率最高的候选慢病毒载体进行大量包装、纯化及病毒滴度测定。将获得的病毒感染H446细胞，实验分为正常未干扰细胞组、感染空对照病毒的阴性对照组、感染PTN基因RNA干扰病毒抑制组、化疗组及感染PTN基因RNA干扰病毒抑制加化疗组。采用四甲基偶氮唑盐比色法（MTT）检测细胞生长，流式细胞仪（FCM）分析细胞凋亡。RT-PCR检测未干扰细胞组、阴性对照组、PTN抑制组和PTN抑制加化疗组细胞中Amot、Slfn5、MMP-9和VEGF的表达。采用H446细胞直接皮下接种的方法构建人小细胞肺癌H446细胞裸鼠异种移植瘤动物模型，分为正常未干扰组，化疗（顺铂）组，干扰PTN的病毒组，化疗+干扰PTN的病毒组和阴性病毒对照组。瘤体附近多点皮下注射病毒或顺铂后，分别于第1、2、7、15天测量瘤体体积。并在治疗第15天分别用RT-PCR和Western blot方法检测正常未干扰组、阴性病毒对照组及干扰PTN的病毒组中PTN的表达。
　　 结果：RT-PCR和Western blot检测结果均表明，PTN基因在H446细胞中表达显著高于H460细胞。构建的慢病毒载体经测序验证正确。所构建的shRNA序列（GCAGCTGTGGATACTGCTGAA）对PTN mRNA的抑制效率为72％，对PTN蛋白的抑制效率为59.2％。大量包装与纯化后病毒滴度为1×108 TU/ml。PTN基因抑制组的H446细胞活力显著低于正常未干扰组和阴性对照组细胞，基因抑制联合化疗组较单纯基因抑制组及化疗组细胞活力下降，细胞凋亡率增高，并具呈浓度依赖性。PTN基因沉默后，H446细胞中Slfn5和MMP-9的表达分别较阴性对照组上调了165.1％和47.3％，而Amot和VEGF的表达分别较阴性对照组下调了33.1％和26.6％。协同化疗后，上述趋势更为明显。动物实验瘤体组织中干扰PTN病毒组PTN mRNA和PTN蛋白的表达明显低于正常未干扰组及阴性病毒对照组，抑制率为分别为39％及28％。干扰PTN病毒组瘤体体积显著小于正常未干扰组及阴性病毒对照组，若协同化疗则瘤体缩小更明显。
　　 结论：构建PTN RNA干涉载体，转染后可有效降低H446细胞PTN的转录和表达，抑制H446细胞的生长并促进其凋亡，并可进一步影响H446细胞增殖和转移相关基因的表达变化。动物实验也显示针对PTN基因靶向治疗可显著抑制移植肿瘤在体内的生长，若与化疗协同则抑制作用更强。有望为小细胞肺癌基因治疗提供一种选择的治疗手段。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略词对照表

引 言

第一部分：人小细胞肺癌细胞株H446 和大细胞肺癌细胞株H460 中PTN 基因的表达

第二部分：慢病毒原理介绍

第三部分：PTN 基因的RNA 干扰慢病毒表达载体的构建

第四部分：PTN 基因沉默后对人小细胞肺癌H446 细胞株生长与凋亡的影响

第五部分：人小细胞肺癌H446 细胞多效蛋白基因沉默后部分肿瘤生长相关基因表达情况分析

第六部分：靶向PTN 的SiRNA 抑制人小细胞肺癌H446细胞裸鼠异种移植瘤的实验研究

综述：多效蛋白（pleiotrophin）的研究进展

读学位期间公开发表的论文

致 谢