猪链球菌2型谷氨酸脱氢酶的克隆表达、单抗制备及核酸疫苗的初步研究

摘要

猪链球菌(Streptococcus suis，S.suis)是一种重要的人畜共患病病原体，能够引致猪和人的脑膜炎、败血病、胸膜炎、关节炎、永久性耳聋及突发性死亡，给人民的生命和财产构成极大威胁。 猪链球菌的种类繁多，毒力因子非常复杂，主要有荚膜多糖、溶菌酶释放蛋白、胞外因子、溶血素等。相继有学者报道新发现的毒力相关因子，谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase,GDH)即为其中之一。但是国际上对这些毒力相关因子还存在争论。目前国内仅对猪链球菌2型的毒力因子MRP、EF及溶血素有一些相关报道，对于近年来不断出现的新的毒力相关因子还缺乏相应的研究。谷氨酸脱氢酶是连接碳代谢和氮代谢的一个关键酶，是细菌能量代谢过程中十分重要的功能分子，对其致病性有重要意义；它同时还是一种进化上极为保守的蛋白，是病原体种属鉴定时重要的诊断性抗原。 本实验克隆表达猪链球菌2型GDH，并对其酶活性进行研究，且探讨了GDH在猪链球菌检测方法的建立及疫苗研制中的应用价值。 1.猪链球菌2型谷氨酸脱氢酶编码基因克隆、序列分析及原核表达 根据已发表的猪链球菌2型的gdh基因设计引物，扩增海安病人分离株Habb中的目的基因，并进行序列测定和分析；构建重组表达载体pGEX4T-2-gdh，在大肠杆菌中表达，并纯化重组蛋白。结果克隆到的猪链球菌gdh编码基因经测序含1347bp；序列分析表明猪链球菌GDH属于GDH蛋白家族工；表达产物为带有GST标签的融合蛋白，分子量为71kDa；用凝血酶切掉GST标签后的产物分子量为45kDa。 2．基因工程猪链球菌2型GDH酶活性测定及其免疫原性研究 检测表达的猪链球菌谷氨酸脱氢酶的酶活性，利用PCR方法检测gdh基因在猪链球菌不同血清型中的存在情况，利用重组蛋白制备多克隆抗体，运用Western blot方法分析其与猪链球菌不同血清型的免疫反应情况。GDH活性测定显示猪链球菌GDH是NADP(H)-特异性GDH，利用α-酮戊二酸做底物，用NADPH做辅酶催化氨的同化和谷氨酸的合成。gdh基因在猪链球菌大部分血清型中保守存在，重组表达的蛋白具有免疫原性。 3猪链球菌2型GDH单克隆抗体的研制 以猪链球菌全菌以及基因工程GDH为抗原，分别免疫BALB／c小鼠，将免疫的小鼠脾细胞与小鼠SP2／0骨髓瘤细胞进行融合，经ELISA方法筛选阳性克隆，再用有限稀释的方法进行克隆化培养，最后共获得四株能稳定分泌抗GDH单克隆抗体(McAbs)的杂交瘤细胞株。 4信号肽与猪链球菌2型GDH融合的DNA疫苗的构建及免疫保护研究 在猪链球菌抗原gdh基因的5’末端引入人IL-2信号肽序列，通过PCR进行拼接，得到的融合DNA片段经过酶切克隆入质粒pcDNA3，构建核酸疫苗pcDNA3-Lg，通过肌肉注射途径将这种DNA疫苗免疫小鼠，最后用猪链球菌强毒株攻击。结果pcDNA3-Lg在小鼠体内表达出正确的目的蛋白，小鼠产生相应的体液免疫应答并对强毒株的攻击有一定保护作用。

目录

文摘

英文文摘

前言

学位论文独创性声明及使用授权声明

第一部分文献综述 第一章猪链球菌毒力因子和鉴定方法的研究进展

第一部分文献综述 第二章猪链球菌引致的猪链球菌病概况

第二部分实验研究 第一章猪链球菌2型谷氨酸脱氢酶编码基因克隆、序列分析及原核表达

第二部分实验研究 第二章基因工程猪链球菌2型GDH酶活性测定及其免疫原性研究

第二部分实验研究 第三章猪链球菌2型GDH单克隆抗体的研制

第二部分实验研究 第四章信号肽与S.suis GDH融合的DNA疫苗的构建及免疫保护研究

致谢