Nogo-C点突变的发现及其促细胞凋亡机制研究

摘要

本文从分子水平上进一步探讨了Nogo-C与肝癌的关系，并研究了Nogo-C的细胞生物学功能。主要取得以下结果： 1．发现Nogo-C在肝癌病人癌组织和正常组织中转录水平上差异表达。Nogo-C在肝癌病人组织中可检测到的阳性表达率为38％(16/412)，其中，瘤径≥5cm和病理分级Ⅲ期的肝癌病例中Nogo-C显著下调。 2．在差异表达的启东肝癌病人组织中首次发现了Nogo-C存在三处点突变： A172G(Thr58Ala)；A340G(Arg114Gly)；A571G(Ilel91Val)。Nogo-C完整阅读框为600bp，编码199个氨基酸。在Nogo-C表达阳性的来自启东的6例肝癌病人中，有5例发生了突变或杂合突变。突变型Nogo-C我们提交在NCBI上的序列号为DQ778739。 3．实验证明突变型Nogo-C通过JNK-c-Jun途径促进HEK293细胞凋亡。我们首先制备了高效的Nogo-C多抗，检测了Nogo-C在HEK293细胞中内源和外源性表达。通过检测JNK-c-Jun通路中信号分子的激活和利用JNK特异性抑制剂，正反向证明了Nogo-C的凋亡途径。 4．发现Nogo-C的突变位点后，我们选择了SMMC-7721为实验对象，将突变型Nogo-C稳定转染肝癌细胞株SMMC-7721，发现Nogo-C抑制了细胞生长速度，促进细胞凋亡，免疫组化结果显示突变型p53由细胞核转移到细胞浆，Hsp70表达量明显减弱且集中在细胞浆，推测Nogo-C可能通过抑制突变型p53的功能促进细胞凋亡，但其确切机制还有待于进一步探讨。 5．构建了Nogo-C突变型和野生型重组腺病毒载体，为进一步探讨Nogo-C对肝癌细胞的生长和凋亡的影响及其机制做准备。 以上结果提示，Nogo-C在肝癌病人中存在有义点突变，且Nogo-C可能通过抑制突变型p53从而抑制肝癌细胞SSMC-7721生长和的凋亡；同时突变型Nogo-C可以通过JNK-c-Jun通路促进HEK293细胞凋亡。

目录

声明

第一部分综述

第一节编码内质网蛋白家族RTNs

第二节Nogo基因的特征

第三节Nogo-C的特征

第四节Nogo基因的功能

第五节Nogo-C与肝癌的关系

参考文献

第二部分实验研究第一章Nogo-C在肝癌病人中的表达特征及点突变的发现

第一节RT-PCR技术检测Nogo-C在肝癌病人中转录水平的表达特征

一、实验材料和方法

二、实验结果

三、讨论

第二节肝癌病人中Nogo-C点突变的发现

一、材料和方法

二、实验结果

三、讨论

第二部分实验研究第二章Nogo-C通过JNK-c-Jun通路促进HEK293细胞凋亡

第一节Nogo-C多抗的制备及内源和外源性表达的检测

一、实验材料

二、实验方法

三、实验结果

四、讨论

第二节突变型Nogo-C促进HEK293细胞凋亡的信号通路研究

一、材料和方法

二、实验结果

三、讨论

第二部分实验研究第三章Nogo-C对肝癌细胞生物学效应研究

第一节Nogo-C稳定转染SMMC-7721细胞对其生长和凋亡的影响

一、材料和方法

二、结果

三、讨论

第二节利用腺病毒系统探讨野生型和突变型Nogo-C对肝癌细胞株增殖和凋亡的研究

一、材料和方法

二、实验结果

三、讨论

参考文献

全文小结

附录

致谢