大肠杆菌ggt的克隆、表达以及利用重组GGT合成L-茶氨酸的研究

摘要

茶氨酸(Theanine)是1950年首次从绿茶中分离得到的，是茶叶中的特征氨基酸，也是茶叶的呈味物质之一，具有很好的生理功能和商业价值。其制备研究是目前茶学研究中的一个热点。由于从茶叶中提取高纯度的茶氨酸，成本高昂；化学合成茶氨酸工艺较复杂：组织培养合成茶氨酸产量低。开展茶氨酸的生物合成研究具有重要的理论意义和实践价值。本论文针对茶氨酸的生物转化法制备技术，开展了工程菌构建工作，将生物技术运用到天然产物制备技术中。通过基因克隆技术构建了重组菌，优化了重组γ-爸氦酰转肽酶的诱导表达条件，优化了重组谷氨酰转肽酶(glutamyltranspeptidase，GGT)粗酶液催化合成茶氨酸的条件，重组菌株粗酶液酶活达到出发菌株粗酶液的35倍，茶氨酸产量达到26.9g/L。主要研究结果如下： 1、以Escherichia coli K-12(E.coli K-12)全基因组DNA为模板进行PCR反应，将扩增出的r-谷氨酰转肽酶基因片断和载体pET28a相连接构建重组质粒pET28a-ggt，将重组质粒pET28a-ggt转化至E.coli BL21中，构建重组菌。 2、为优化以IPTG作为诱导剂对重组菌进行诱导表达的条件，选择菌液初始诱导OD600、诱导时间和IPTG的浓度为自变量，重组GGT表达量为响应值，采用中心组合设计的方法，研究各自变量及其交互作用对重组GGT表达量的影响。利用响应面分析的方法，模拟得到二次多项式回归方程的预测模型，并确定对重组菌进行诱导表达的最佳条件为：菌液起始诱导OD600为0.52，IPTG浓度为0.42mM，诱导时长为7h。在此条件下，获得的重组菌GGT粗酶液的转移酶活性达到81.8625U/ml左右，约是出发菌株粗酶液的35倍。 3、对γ-谷氨酰转肽酶的大、小亚基分别进行PCR扩增、表达载体构建和转化，最终得到大亚基重组菌BL21(pET28a-ggtl)和小亚基重组菌BL21(pET28a-ggts)。诱导表达后进行酶活分析，结果表明：相比出发菌株GGT粗酶液，由重组菌BL21(pET28a-ggtl)和BL21(pET28a-ggts)得到的GGT大小亚基粗酶液转移酶活性均无明显提高。 4、优化了重组GGT粗酶液催化L-谷氨酰胺和乙胺合成茶氨酸的反应条件，重组菌经37℃培养至菌液OD600为0.52，加1PTG至0.42mM于20℃诱导表达7h收集菌体制得GGT粗酶液.1ml反应体系(含267mM L-谷氨酰胺、2.0M乙胺、16U粗酶液、pH10.0)于37℃反应4小时，茶氨酸的最大生成量为26.9g/L，L-Gln转化率为57.8％。Suzuki等报道的用构建的重组菌催化L-谷氨酰胺(L-Gln)和乙胺合成茶氨酸的量为20.9g/L，L-Gln转化率为60％。本实验中的L-Gln转化率稍低，但是茶氨酸产量有所提高。 本实验构建的重组菌GGT粗酶液具有较好的催化L-谷氨酰胺和乙胺合成茶氨酸的能力，可以尝试用其进行扩大生产茶氨酸的中试实验，可以尝试将其他不同表达载体和表达宿主菌，以寻找更适合GGT大量表达的载体系统。本实验对于生物转化法工业化生产茶氨酸等方面的工作具有较好的指导作用和实际价值。

目录

论文说明:符号、缩略用语等专用术语注释表

声明

摘要

前言

一、L-茶氨酸研究的历史与现状

二、茶氨酸体内生物合成途径

三、L-茶氨酸的生理功能研究与开发利用前景

四、茶氨酸制备技术的研究现状

五、茶氨酸测定方法

六、γ-谷氨酰转肽酶

七、pET系统

第一章实验设计方案

1实验目的

2本实验的实验内容

3技术路线

第二章γ-谷氨酰转肽酶的克隆、诱导表达及活性鉴定

1实验材料

2实验方法

3实验结果

4讨论

第三章响应曲面法优化γ-谷氨酰转肽酶的诱导表达

1实验材料

2实验方法

3实验结果

4讨论

第四章γ-谷氨酰转肽酶的大小亚基基因分别克隆与表达初探

1实验材料

2实验方法

3实验结果

4讨论

第五章重组γ-谷氨酰转肽酶催化合成L-茶氨酸反应条件优化

1实验材料

2试验方法

3结果与分析

4讨论

结论

参考文献

附录 研究生阶段发表论文

致谢