商陆组织培养及绿色荧光蛋白基因工程菌构建

摘要

商陆（Ｐhytolaccaceae)为商陆科多年生草本植物，我国具有丰富的野生资源。商陆被广泛用于医药、病虫害防治、食品着色以及植物修复等方面。但是由于野生型商陆的生长周期比较长，而且商陆自身具有毒性，商陆的栽培和应用受到很大的困扰。因此，开发商陆的遗传转化技术，从分子层面上来研究商陆，对我们更深入的研究商陆富集重金属的机理及其与食品安全之间的关系，以及研究开发无毒或低毒、次生代谢产物高产植株、多种重金属富集植株、速生等转基因新品种具有重要的意义。这将为我国商陆的进一步推广应用奠定一个良好的基础。
　　 本研究对商陆种子快速萌发及无菌苗培养的条件、商陆高效再生体系的建立、农杆菌介导的GFP基因转化商陆愈伤组织的参数及转化腋芽原基的参数、转化植株的筛选、转化植株的鉴定等开展了系列研究，得出的主要结论如下：
　　 1、商陆种子萌发及无菌苗培养的最适条件为：商陆种子在酸性消毒液中处理15min，然后接种在MS+20g/L 蔗糖+7g/L 琼脂培养基上，26±1℃
　　 下暗培养1W，萌发率为96.7％，没有污染现象。随后，将光照强度调为1500LUX、光/暗周期12h/12h，2W 后可以成苗，成苗率100％。
　　 2、商陆高效再生体系的建立：我们以商陆的叶片、叶柄、茎段和茎节为外植体，以附加一定植物激素的MS 培养基为诱导愈伤组织和诱导分化培养基，以附加不同浓度的IBA的MS 培养基为生根培养基，建立了商陆高效再生体系。其中（1）愈伤组织诱导最佳激素配比为：叶片： 6-BA 2.0 mg/L，IBA 0.4mg/L；茎段：6-BA 1.0 mg/L，IBA 0.2 mg/L；叶柄： 6-BA 1.0 mg/L，IBA 0.2 mg/L；在最适培养基上所有外植体的愈伤组织诱导率都为100％。（2）茎节腋芽分化增殖最佳激素配比为6-BA 1.0 mg/L，IBA0.2mg/L；（3）最佳诱导生根培养基为：1/2MS+IBA 0.2 mg/L+蔗糖 20 g/L+琼脂 7.0 g/L；
　　 3、商陆外植体对抗生素卡那霉素（Km）和潮霉素（Hyg）的敏感性不同，潮霉素50 mg/L 就可以完全抑制商陆外植体愈伤组织的产生和分化，而卡那霉素.则需要 100 mg/L；但分化芽的生根对卡那霉素和潮霉素都十分敏感，少量抗生素就可以完全抑制商陆分化芽的生根。
　　 4、以中间载体PBI121 为基础，以EGFP 序列为目的片段插入DNA，构建了在植物中可以表达的中间表达载体。通过PCR和酶切验证，表明中间表达载体已经构建成功，并已经转入到农杆菌中，为下一步商陆的转基因研究奠定了基础。
　　 5、以商陆无菌苗的叶片、茎段以及茎节为外植体，根癌农杆菌EHA105 为介导，采用叶盘转化法进行GFP基因对商陆的转化做了初步的研究，为商陆遗传转化体系的建立奠定了基础。

目录

文摘

英文文摘

声明

第1章 绪论

第2章 美洲商陆无菌苗的培养

第3章 商陆组织培养体系的建立

第4章 GFP 基因工程菌的建立

第5章 GFP 基因对商陆的遗传转化

结语

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间的研究成果及所发表的论文