烟草碱性β-1,3-葡聚糖酶基因转化‘DoubleMariachiPink’洋桔梗的研究

摘要

洋桔梗（Eustoma grandiflorum）属龙胆科一、二年生的草本观赏植物，原产于美洲中部地区。它具有色彩丰富、花朵美丽等特点，作为切花新秀，越来越受到人们的喜爱，是近年来世界上十分流行的十大切花之一。
　　 然而，洋桔梗在栽培中很容易受真菌的侵害，由真菌引起的病害占其总病害的80％。本研究以洋桔梗‘Double Mariachi Pink'品种为试验材料，将烟草抗真菌的β-1,3-葡聚糖酶基因，通过农杆菌介导法转入其中，以期培育出抗真菌的洋桔梗新种质。
　　 首先，以烟草基因组DNA为模板，根据烟草‘Samsun'抗真菌的碱性β-1,3-葡聚糖酶基因序列设计引物，利用PCR方法扩增出特异的目的基因，并对其进行了生物信息学分析。该序列（GenBank 登录号：EU867448）全长1868bp，包含2个外显子和1个内含子；除终止密码子外，共编码359个氨基酸。该酶分子量为28.4kD，pI为9.72，是一个碱性蛋白。该酶蛋白与颠茄、马铃薯等茄科植物的β-1,3-葡聚糖酶氨基酸序列同源性分别达到89％和81％。
　　 然后，将该基因回收克隆，与pBI121重组，成功构建了植物表达载体pBI121-glu，并将其导入农杆菌LBA4404；再利用本实验室已优化的洋桔梗叶片遗传转化体系，通过农杆菌介导法转化洋桔梗‘Double Mariachi Pink'品种。
　　 最后，对洋桔梗的卡那霉素抗性再生植株进行检测。32个再生株系的抗性苗经生根筛选，有17个株系生根，生根率为53.1％；对这17个株系进行GUS组织化学染色，7个株系有gus基因表达；为了防止gus基因整合却未表达的情况，又对这17个株系进行PCR 扩增，有10个株系呈阳性，其中6个株系为gus基因表达株；最后对该6个PCR和GUS组织化学染色阳性的株系进行Southern杂交，最终得到3株转化株系，阳性率为9.4％。

目录

文摘

英文文摘

声明

前言

第一章 抗真菌的β-1,3-葡聚糖酶基因的克隆及生物信息学分析

第二章 β-1,3-葡聚糖酶基因植物表达载体的构建及对洋桔梗的转化

第三章 转化再生植株的检测

全文结论

参考文献

附录

致谢