基于CIA大鼠两种抗原短肽特异性自身免疫反应的实验研究

摘要

研究背景:
　　 类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种典型的由抗原驱动和T细胞介导的慢性、进行性的自身免疫性疾病。其特征是外周循环中可检出大量的针对自身抗原成分的自身抗体和抗原特异性T、B淋巴细胞。该病病因复杂,发病机制尚不明确。目前尚缺乏有效的早期诊断指标。该病病变主要累及外周小关节,最终可能会导致进行性关节破坏、畸形,甚至功能丧失。胶原诱导性关节炎(collagen-induced arthritis,CIA)模型是通过用Ⅱ型胶原(typeⅡ collagen,CⅡ)免疫鼠类诱导的多关节炎症。由于其引起的症状和关节病理与RA有诸多相似之处而被认为是人类RA的独特动物模型,被较广泛地用于RA机制的研究。
　　 目的:
　　 建立新的血清学实验诊断体系,寻找新的自身抗体标志物,观察环瓜氨酸肽(CCP)及Ⅱ型胶原短肽(CⅡ260-272)作为特异性抗原刺激物对胶原诱导型关节炎(CIA)大鼠淋巴细胞激活的影响,以及经上述特异性抗原刺激后细胞上清中IFN-γ等细胞因子的分泌情况,探讨上述抗原在CIA大鼠成模过程中的作用,并为进一步了解其在RA中的作用机制提供理论和实验依据。
　　 方法:
　　 建立CIA大鼠模型,采用肽酰精氨酸脱亚氨基酶(PAD)对牛Ⅱ型胶原(bCⅡ)进行瓜氨酸化(citrullination),同时选择CⅡ短肽(CⅡ260-272)和环瓜氨酸肽(CCP)及PAD酶为包被抗原,建立检测其血清中自身抗体的酶联免疫吸附试验(ELISA)。分别在建模1周、2周…8周后分离、培养大鼠脾淋巴细胞,采用CCK-8法检测CCP及Ⅱ型胶原短肽(CⅡ260-272)对淋巴细胞增殖反应的影响,并用ELISA法检测经上述特异性抗原刺激后细胞上清中IFN-γ、IL-4、IL-17等细胞因子的分泌情况,同时对建模时间、细胞增殖指数及其他血清学指标、关节炎症指数等的关系进行相关分析。
　　 结果:
　　 1、造模后第10d,模型组大鼠即出现肿胀高峰,随着时间的延长,关节炎症指数继续升高,至16d时出现第2个关节炎症高峰。同时模型组大鼠在首次免疫第2w即出现滑膜炎症和血管翳高峰,尽管到后期有所减退,至实验结束时(8w后)仍可观察到较弱的关节滑膜炎症和血管翳形成。病理学观察结果显示,模型组大鼠关节囊滑膜组织呈乳头状突起增生,滑膜层变厚,排列紊乱,滑膜内可见淋巴细胞、浆细胞,以及巨噬细胞、中性粒细胞等炎性细胞浸润,血管翳明显增多。与0周组相比,模型组大鼠寡聚基质蛋白(COMP)表达水平均有不同程度的升高,有显著统计学差异(P均<0.01)。相关性分析表明CIA模型组大鼠血清中COMP表达水平与关节炎症指数(P<0.05)呈显著正相关。
　　 2、血清学指标检测结果显示,模型组大鼠中,抗PAD酶抗体、抗CCP抗体、抗CⅡ短肽抗体及抗CⅡ抗体、抗Cit-CⅡ抗体均出现不同程度的升高,其中尤以抗CⅡ短肽抗体与抗CCP抗体升高更为明显。相关性分析结果表明,前者与关节炎症、滑膜炎、血管翳显著相关(P<0.05或P<0.01)。同时,抗PAD酶抗体与抗CCP抗体、抗CⅡ短肽抗体及抗Cit-CⅡ抗体水平(P均<0.01),抗CCP抗体与抗CⅡ短肽抗体、抗CⅡ及抗Cit-CⅡ抗体(P<0.05或P<0.01)也存在显著相关关系。
　　 3、增殖检测结果显示CCP抗原特异性T细胞(CCP-AST)细胞及CⅡ短肽抗原特异的T细胞(CⅡ-AST)在首次免疫2～3周即出现明显的增殖反应,显著高于实验对照(FLAK肽刺激组)和细胞对照组(0周CCP刺激组)的增殖水平(P<0.01或P<0.05)。相关分析结果表明基于CCP刺激的特异性T细胞增殖刺激指数与CIA病程(建模时间)、关节炎症指数及抗CCP抗体、抗CⅡ短肽抗体产生水平显著相关(P<0.01或P<0.05),但未见CⅡ短肽抗原特异性T细胞增殖反应与抗CⅡ短肽抗体有相关关系(P>0.05)。
　　 4、细胞因子检测结果显示,与对照组相比,早期模型组大鼠血清中IFN-γ、IL-17的分泌水平显著升高(P均<0.01),而IL-4一直保持较低水平。4周开始,IFN-γ水平开始显著下降(P均<0.01)。在两种抗原肽刺激后的细胞培养上清中,IFN-γ和IL-17的检出水平与0周对照组比较,均有显著提高(P均<0.01),与血清中检测结果不同的是,IL-4浓度几乎一直保持较高水平。相关性分析结果表明,经CCP刺激后RSMC分泌产生的IFN-γ、IL-17水平与CCP-AST细胞增殖呈显著正相关性(P均<0.01),并与CⅡ短肽抗原特异性T细胞增殖亦互为相关关系；IL-4的产生水平与CCP-AST细胞增殖亦有相关关系(P<0.05),但与CⅡ短肽特异性T细胞增殖未见相关性。
　　 结论:
　　 成功建立CIA大鼠模型,并对其应用实施效果进行了评价。在CIA大鼠成模过程中,广泛存在着特异性体液免疫和细胞免疫功能异常。除检出抗CⅡ有关的抗体外,还可检出抗PAD酶与抗CCP抗体。CCP及CⅡ260-272短肽抗原可刺激CIA大鼠脾淋巴细胞的体外异常增殖,此种增殖作用在建模早期即可出现,而且上述抗原可在体外诱导细胞因子的分泌,导致Th1/Th2/Th17失衡,这一结果对于提示瓜氨酸化蛋白、CⅡ优势抗原表位及其一系列相关自身抗体在参与RA疾病发生、发展中的作用具有重要意义。