胶原诱导性关节炎小鼠CⅡ短肽抗原特异性淋巴细胞的量子点标记检测与示踪研究

摘要

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种以T细胞浸润关节滑膜为特点引起关节滑膜慢性炎症的自身免疫疾病，可导致软骨破坏和骨侵蚀。目前，关于慢性炎症的维持及其引起的组织损坏的机制尚不明了。研究发现，RA患者体内存在针对Ⅱ型胶原(typeⅡ collagen,CⅡ)、软骨糖蛋白以及许多特异性关节抗原的自身反应性T细胞及自身抗体与RA发病相关。存在于活动性RA关节组织中的CⅡ特异性T细胞(collagen typeⅡ antigen specific T cells，CⅡ-AST)参与维持RA炎症过程。一些关节炎的动物模型常被用来探索滑膜炎的发病机制，如胶原诱导性关节炎(collagen-induced arthritis，CIA)模型。这种实验性自身免疫病在易感性的啮齿类（大鼠和小鼠）动物体内通过用CⅡ诱导可发生自身免疫介导的多关节炎，与人类RA在临床症状、组织学及免疫学上有许多共同点。啮齿类动物对CIA的易感性与主要组织相容复合物Ⅱ类分子(MHCⅡ)相关。CⅡ引发的免疫反应以CⅡ-AST的活化和产生特异性的高滴度抗体为特点，这些都与人RA极为相似。CIA和RA之间的相似性使其广泛应用于RA的实验研究中。
　　研究目的:
　　建立小鼠CIA模型，研究CⅡ-AST的阳性率，探索其与CIA小鼠关节炎症指数、炎症细胞因子及自身抗体产生的相关性。通过量子点(quantum dots，QDs)标记CⅡ短肽活体示踪与免疫组织化学技术寻找CIA小鼠关节滑膜炎症部位特异性T细胞和B细胞存在的证据，阐明CⅡ-AST在CIA疾病发生中的作用。
　　研究方法:
　　在构建CIA小鼠模型的基础上，采用QDs标记链酶亲合素（QD705-SA）结合生物素化的CⅡ短肽对CⅡ-AST进行体外标记，建立CⅡ-AST的流式细胞分析技术(flow cytometry，FCM)，并研究CⅡ-AST阳性率。ELISA法检测CIA小鼠血清抗CⅡ短肽抗体、抗CⅡ全分子抗体、抗CCP抗体水平，探索CⅡ-AST与CIA小鼠关节炎症评分、炎症细胞因子(IL-4、IL-17、IFN-γ)、自身抗体水平的相关关系。通过QDs标记CⅡ短肽(QDs-SA-Bio-CⅡ)尾静脉注射途径，研究其在CIA小鼠体内的荧光分布特征，探索可识别CⅡ短肽的抗原特异性淋巴细胞（特异性T、B细胞）的迁移途径和组织，最后采用免疫组织化学技术研究CIA小鼠关节滑膜组织特异性T、B细胞存在的组织细胞学证据。
　　研究结果:
　　1.成功建立基于QDs标记的检测CⅡ-AST的FCM技术平台，并用于CⅡ-AST检测，结果以CD4+CD8-CⅡ-TCR+细胞为CⅡ-AST。研究结果发现:实验组CIA小鼠CⅡ-AST阳性率(2.351％)显著高于对照组小鼠(0.153％)和对照肽(0.147％)，差异具有统计学意义(P＜0.001)。CIA小鼠血清抗CⅡ短肽抗体、抗CⅡ全分子抗体、抗CCP抗体水平均较对照鼠显著增高（P＜0.01）。同时，CIA小鼠IL-17水平较对照鼠增高，差异具有统计学意义（P＜0.01）。IFN-γ水平也增高，IL-4水平降低，但均无统计学意义。相关分析结果表明，CIA小鼠CⅡ-AST阳性率与关节炎症指数、抗CⅡ短肽抗体、抗CⅡ全分子抗体、抗CCP抗体水平以及IL-17水平均呈显著正相关关系（r分别为0.883、0.846、0.796、0.875和0.769，P均＜0.01），未发现其与IL-4、IFN-γ水平间存在相关关系。
　　2.将QDs-SA-Bio-CⅡ经尾静脉注射到CIA小鼠体内，通过小动物成像分析系统进行示踪研究，观察其在CIA小鼠体内的荧光分布特征。结果在CIA小鼠关节炎症部位定位到与CⅡ短肽相关的特异性阳性信号。这有可能是抗原特异性T、B细胞识别QDs-SA-Bio-CⅡ并将其聚集于关节滑膜所致。注射QDs-SA-Bio-CⅡ20min后，CIA小鼠关节炎症部位荧光开始增强，2h后荧光强度最高，并维持到4h左右。之后荧光强度开始逐渐减弱，6h之后基本回到背景荧光水平。注射QDs-SA-Bio-CⅡ的实验组CIA小鼠在20min、2h和4h时关节炎症部位荧光强度的平均数分别为4.21×105 Photons/s/cm2/sr，5.36×105Photons/s/cm2/sr和1.96×105 Photons/s/cm2/sr，明显高于同时间点对照组(P＜0.05)。各脏器荧光成像分析显示，与注射生理盐水的对照鼠比较，注射QDs-SA-Bio-CⅡ6 h之后的CIA小鼠肝脏荧光强度较高，其他器官（心、肾、脾、肺）的荧光强度则相对较低。
　　3.组织病理学分析发现，与对照组小鼠比较，CIA小鼠关节滑膜和关节腔中可见大量的单个核细胞浸润，通过En Vision二步染色法可见到CD4+T细胞和CD19+B细胞，而对照小鼠未观察到该类细胞群的存在。同时，利用QDs免疫荧光组织化学技术初步检测到CIA小鼠关节滑膜中IgG类膜表面Ig的B细胞，但并未检测到CⅡ-AST。
　　结论:
　　成功建立了基于QDs标记CⅡ-AST的FCM，发现CIA小鼠CⅡ-AST阳性率显著增高，并与关节炎症指数、相关自身抗体及细胞因子产生密切相关。在关节炎症部位发现有针对CⅡ短肽的特异性阳性荧光信号，并存在有CD4+T细胞、CD19+B细胞及IgG类B细胞的组织学证据。研究结果有助于对RA发病机制的新认识，并为后续研究奠定了重要的方法学基础。

目录

声明

摘要

主要英文缩略词索引

第一章 绪论

1．1 研究背景

1．2 QDs标记在活体动态示踪成像中的应用

1．3 QDs在细胞标记中的应用

1．4 QDs标记在流式细胞术中的应用

1．5 基于QDs标记的免疫荧光组织化学技术

1．6 本项目研究的目的与实验设计

第二章 QDs标记CⅡ抗原特异性T细胞的流式细胞分析及其与自身抗体、细胞因子的关系

2．1 引言

2．2 材料和方法

2．2．1 动物、实验仪器和试剂

2．2．2 实验方法

2．3 结果

2．3．1 QDs标记CⅡ-AST的FCM检测结果图

2．3．2 CIA模型组与对照组小鼠CⅡ-AST阳性率比较

2．3．3 CIA模型鼠和对照鼠血清中三种自身抗体水平

2．3．4 CIA模型鼠和对照鼠血清中三种细胞因子的水平

2．3．5 CIA小鼠CⅡ-AST阳性率、关节炎症指数与三种抗体及三种细胞因子水平的关系

2．4 讨论

第三章 CIA小鼠QDs标记CⅡ短肽抗原特异性淋巴细胞的体内示踪研究

3．1 引言

3．2 材料与方法

3．2．1 试剂及仪器

3．2．2 实验方法

3．3 结果

3．3．1 CIA模型鼠关节炎症

3．3．2 活体荧光示踪

3．3．3 体外脏器荧光成像

3．4 讨论

第四章 免疫组织化学技术研究CIA小鼠关节滑膜组织中的CⅡ短肽抗原特异性淋巴细胞

4．1 引言

4．2 材料和方法

4．2．1 试剂及仪器

4．2．2 实验方法

4．3 结果

4．3．1 CIA模型鼠关节滑膜组织HE染色结果

4．3．2 CIA模型鼠关节滑膜组织CD4+T细胞与CD19+B细胞En Vision二步法免疫酶组织化学染色结果

4．3．3 基于QDs的免疫荧光标记技术检测CIA模型鼠关节滑膜组织B细胞结果

4．4 讨论

结论

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表的文章与参加的学术会议