番茄黄化曲叶病毒基因沉默抑制子V2的作用方式解析

摘要

番茄黄化曲叶病毒(Tomatoyellow leaf curl virus，TYLCV)是一种烟粉虱传播的植物病毒，分类上属于双生病毒科(Geminiviridae)菜豆金黄色花叶病毒属(Begomovirus)，基因组为单链环状DNA分子，大小约2.7kb，共编码六个基因。其中V2(以色列分离物，TYLCV-Is)可以抑制本氏烟中35S：GFP(GFP)的局部沉默，具有基因沉默抑制子的特征。近年来TYLCV在我国肆虐危害，给我国的番茄产业造成了惨重的损失，本论文以此为切入点对我国发生的TYLCV-XH2(与TYLCV-Is同源性97.95％)V2的基因沉默抑制子特征进行了研究。
　　用pET-32a原核表达载体在大肠杆菌中表达了TYLCV-XH2 V2蛋白，以Ni+-NTA亲和柱纯化的重组蛋白为抗原免疫新西兰大白兔制备了V2蛋白的多克隆抗体anti-V2，间接ELISA测定anti-V2的效价达1:655360。
　　将TYLCV编码的基因(V1，V2，C1，C2和C3)与GFP共浸润GFP16c本氏烟，浸润6天后在紫外下观察，发现只有V2浸润区有绿色荧光，说明V2可以抑制16c本氏烟局部沉默。V2浸润区的绿色荧光与HC-Pro相比较弱，说明V2的局部抑制效果不强。而将V1，V2，C1，C2和C3这5个基因与GFP和35S：dsGFP(dsGFP)共浸润普通本氏烟，发现5个基因均不能抑制普通本氏烟上由外源dsGFP诱导的局部沉默。
　　将V2与GFP共浸润16c本氏烟，浸润30天后紫外下观察，发现16c本氏烟的系统叶仍有绿色荧光，说明V2具有抑制16c本氏烟系统沉默的功能。而将V2与GFP分别浸润16c本氏烟叶片的不同部位(叶基部、叶尖部)或者不同部位的叶片(上部、下部)，发现当V2浸润部位在叶基部或者下部叶片时，植株的系统沉默比率明显的降低，说明V2可以抑制16c本氏烟中GFP基因沉默信号的传导。
　　将构建到PVX表达载体上的V2(pGR107-V2)浸润接种GFP已诱导沉默的16c本氏烟，浸润30天后发现，浸润植株整株及新长出的叶片仍保持红色，表明V2不能回复已建立的沉默，可能不作用于沉默的起始和维持阶段。同时pGR107-V2接种番茄和本氏烟30天后发现无明显症状，表明在PVX异源表达系统中单独的V2并不能致病。
　　上述研究结果表明TYLCV-XH2 V2基因是RNA沉默抑制子，且V2基因单独不直接引起致病性。

目录

文摘

英文文摘

第一章 文献综述

1 双生病毒简介

2 番茄黄化曲叶病毒的研究进展

2.1 番茄黄化曲叶病毒的发生及危害

2.2 番茄黄化曲叶病毒的分类地位

2.3 番茄黄化曲叶病毒的基因组结构及功能

3 RNA沉默(RNA silencing)简介

3.1 RNA沉默的发现

3.2 RNA沉默与植物抗病毒的防御机制

4 病毒编码的RNA沉默抑制子

4.1 RNA沉默抑制子的发现和已鉴定的沉默抑制子

4.2 沉默抑制子的分子机制

4.3 沉默抑制子在植物体系中的鉴定方法

5 双生病毒中已鉴定的基因沉默抑制子

6 研究意义

第二章 番茄黄化曲叶病毒V2基因的原核表达与多克隆抗体制备

1 材料与方法

1.1 植物材料

1.2 酶、生化试剂及其他材料

1.3 方法

2 结果与分析

2.1 TYCV V2基因的克隆及分析

2.2 原核表达载体构建及重组质粒的鉴定

2.3 重组蛋白的表达、纯化、SDS-PAGE电泳

2.4 TYLCV V2多克隆抗体的效价

2.5 Western blot分析

2.6 DIBA检测植物蛋白

3 讨论

第三章 番茄黄化曲叶病毒V2基因沉默抑制子作用方式解析

1 材料和方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果与分析

2.1 TYLCV编码的基因的克隆与载体构建

2.2 TYLCV V2能抑制GFP在16c转基因本氏烟的局部沉默

2.3 TYLCV V2不能抑制GFP在非转基因本氏烟的局部沉默

2.4 TYLCV v2能抑制(IFP 16c转基因本氏烟中系统沉默

2.5 TYLCV V2能抑制GFP 16c转基因本氏烟中系统沉默信号的传导

2.6 TYLCV V2不能回复已建立的沉默

2.7 在PVX异源表达系统中TYLCV V2单独不能致病

3 讨论与分析

附录A 常用术语缩写与中英文对照

附录B 常用生化及分子生物学试剂与仪器

附录C 常用缓冲液及培养基配方

参考文献

在读期间发表的学术论文及研究成果

致谢