猪链球菌反应调节因子CovR靶基因的鉴定及其磷酸化调控系统Stk/Stp蛋白的原核表达

摘要

猪链球菌(Steptococcus suis，简称S.suis)是一种重要人畜共患病病原菌。该菌可感染猪致关节炎、脑膜炎、败血症等，并且可通过伤口等传播途径，导致人的感染发病，不仅对养猪业造成威胁，而且严重影响公共卫生安全。近年来的研究表明二元信号转导系统在调节致病菌毒力基因表达以及构成细菌致病性等方面发挥着重要的作用。
　　本课题组在前期研究2型猪链球菌(S.suis2)致病机制的过程中，发现二元信号转导系统反应调节因子CovR直接或间接调节了S.suis2全基因组中近8.9％的基因表达，其中包括一些已知的或潜在的与S.suis2致病性相关的基因，是全面调节基因表达的负调控因子。为了深入了解CovR在S.suis2致病过程中发挥的作用，课题组致力于CovR对细菌毒力的调控机制的研究。
　　本研究利用染色质免疫共沉淀实验筛选与CovR直接结合的靶基因:以S.suis205ZYH33菌株为材料，1％甲醛固定使蛋白质与DNA交联，通过超声处理将基因组DNA切为100-500bp的片段后，用CovR特异性单抗免疫沉淀该蛋白质-DNA片段，再解交联纯化DNA片段;最后经PCR检测成功筛选出被CovR调节的2个靶基因ssu051668和ssu051732。
　　近年来在S.agalactiae、S.pneumoniae等链球菌的研究中发现CovR受到真核样丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的磷酸化作用，提示我们在猪链球菌中可能也存在着Stk/Stp磷酸化系统，可以使CovR磷酸化或去磷酸化从而调节CovR蛋白的活性。对实验室保存的S.suis205ZYH33基因组注释进行分析，发现ssu05_0428和ssu050427基因分别编码丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(Stk)及其相应磷酸酶(Stp)。以S.suis205ZYH33基因组为模板，扩增stk, stp，Ⅳ-stk,将不同的DNA片段分别转入表达载体pET28a，构建重组表达载体，His亲和层析柱纯化得到较高纯度的N-Stk蛋白和Stp蛋白。
　　本研究成功筛选出CovR调控的靶基因，同时原核表达、纯化获得了重组N-Stk蛋白和Stp蛋白，为进一步探讨CovR磷酸化在猪链球菌致病过程中发挥的作用，系统阐述CovR对2型猪链球菌的调控机理奠定基础。

目录

声明

摘要

第1章 绪论

1．1 二元信号转导系统的简介

1．2 链球菌二元信号转导系统CovS／CovR的研究进展

1．3 链球菌CovR磷酸化作用机制的研究

1．4 本研究的目的

第2章 猪链球菌反应调节因子CovR调控靶基因的筛适量鉴定

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

第3章 猪链球菌Stk和Stp的原核表达及纯化

第一节 猪链球菌Stk和Stp生物信息学分析及血清型分布

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

第二节 猪链球菌Stk和Stp的原核克隆与表达

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

第4章 结论

参考文献

在读期间发表的学术论文及研究

致谢