海栖热袍菌来源的半纤维素酶系协同降解反应的研究

摘要

随着社会经济的快速发展，石油危机及当今世界对能源需求的急剧增加，加快了人们开发可再生清洁能源的步伐，在自然界中，半纤维是仅次于纤维素的生物质资源，它与纤维素和木质素交联在一起，要实现对其彻底降解，需要多种酶类协同作用，本文将关注点集中到一类半纤维素-木葡聚糖，已往的研究对其在生物质降解中的重要性缺乏足够的重视，本文着重对木葡聚糖降解的关键酶α-木糖苷酶进行超量表达及酶学性质分析，并对木葡聚糖进行体外酶联降解，另外，用重组高效表达的耐热木聚糖酶系分别降解提纯的桦树、甘蔗渣、玉米芯和蓝莓渣木聚糖，并对降解产物进行定性及定量分析。 1.通过研究海栖热袍菌（Thermotoga maritima MSB）基因组，推测其中含有一个与降解木葡聚糖有关联的基因簇，以基因簇中的α-木糖苷酶XylG为研究对象，将其克隆到高效热激表达载体pHsh上，得到pHsh-xylG，通过基因定点突变的方式实现了其在大肠杆菌中的高效表达，首先对重组质粒TIR区的mRNA二级结构在线分析使RBS及ATG从发卡结构的互补配对区中释放出来，其次，将基因N端翻译起始区的一段较集中的稀有密码子作修改，得到了突变质粒pHsh-xylGⅡ和pHsh-xylGⅢ，并将它们分别转入大肠杆菌DH10B中热激诱导表达，优化后的重组质粒表达量提高了15倍。SDS-PAGE密度扫描结果显示最终重组酶的表达量占到总可溶性蛋白表达量的40％，表明其N端稀有密码子严重影响基因的高效表达。 通过热处理，DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析等步骤对重组酶进行提纯，纯化后的酶在SDS-PAGE胶上为单一电泳条带，分子量88kDa，所得纯酶的比酶活为55.7U/mg，酶的纯化倍数为12.5倍，得率是86.7％。纯化结果显示，用热处理去除宿主蛋白，目的蛋白达到电泳纯，回收率达到80％，这一结果表明在今后的工业化应用中可以用热处理这种低成本而简便的方式制备该酶。 另外，我们对纯化后的重组酶进行酶学性质分析，重组酶对底物pNPS的活性测定结果表明，该酶的最适pH为5.0，且在pH5.0-7.5范围内，酶活性均能维持在60％以上。最适温度为85℃，重组酶热稳定性为85℃保温1h酶活保持在80％，热稳定性非常好。金属离子和抑制剂等对酶活影响的研究发现:Co2+、Ni2+、Li1+、EDTA对酶的活性没有显著影响; Zn2+、Cu2、Fe2+对酶活均有显著的抑制作用。Mn2+、Sr2+、Mg2+、Triton-(Ⅹ)100对酶活有显著的促进作用。根据公式按Eadie-Hofstee作图法作图分析该重组酶对pNPS底物的动力学参数。根据线性回归方程计算Km为0.04 mmol，Vmax为78 U/mg。 2.将基因簇中的β-半乳糖苷酶基因galC和α-岩藻糖苷酶基因afuD克隆到高效热激表达载体pHsh上，分别得到pHsh-galC和pHsh-afuD，并在大肠杆菌中实现了超量表达。结合本实验室以研究的海栖热袍菌来源的纤维素酶CelB、内切葡聚糖酶Cel74、β-葡萄糖苷酶BglA和α-阿拉伯糖苷酶AraB，用这几种酶联合降解木葡聚糖（罗望子）TLC分析结果显示，XylG对木葡聚糖的降解至关重要。Cel74降解木葡聚糖比CelB特异性更高。而GalC和AraB也有促进降解作用。 3.利用本实验室已构建的木聚糖降解酶系，包括内切木聚糖酶XynB，β-木糖苷酶XylC，α-阿拉伯糖苷酶AraB。我们又构建了海栖热袍菌来源的葡萄糖醛酸酶重组质粒pHsh-aguA，并在大肠杆菌中超量表达。用这些酶协同降解从桦树、甘蔗渣，玉米芯和蓝莓渣提取的天然木聚糖，TLC分析结果显示，针对不同植物来源的木聚糖需要选择相应的木聚糖酶系去联合降解，通过合理的酶联反应，多酶联用可有效将玉米芯和蓝莓渣来源的木聚糖降解为单糖，在对甘蔗渣的降解反应中，我们发现有两条寡糖链是上述酶无法降解的，通过颜色判断有可能是葡萄糖组成的寡糖链，当加入β-葡萄糖苷酶后，两条寡糖链被降解。这一发现在之前未有报道，我们推测在甘蔗渣中含有一种特有的葡聚糖。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1 可再生资源-半纤维素

2 木葡聚糖的结构及其降解酶系

3 木聚糖的结构及其降解酶系

5 α-木糖苷酶的研究进展

6 新型大肠杆菌表达载体-pHsh

7 立题背景及研究

7．1 立置背景

7．2 研究内容

第二章 海栖热袍菌来源的α-木糖苷酶的克隆、表达及定性

1 材料

1．1 菌种和质粒

1．2 培养基

1．3 主要试剂及其来源

1．4 主要设备及其来源

1．5 DNA引物合成和DNA测序服务

2 方法

2．1 大肠杆菌感受细胞的制备及转化

2．2 琼脂糖电泳胶回收DNA片断和质粒抽提

2．3 DNA磷酸化、去磷酸化反应以及连接反应

2．4 海栖热袍菌的厌氧瓶液体培养

2．5 基因组DNA的提取

2．6 聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE

2．7 α-木糖苷酶基因的表达载体pHsh-xylG的构建

2．8 优化的α-木糖苷酶基因表达载体pHsh-xylGⅢ的构建

2．9 α-木糖苷酶基因在原核表达载体中的表达

2．10 重组酶的分离纯化

2．11 酶的活性测定

2．12 重组酶的性质分析

3 结果与分析

3．1 原核表达质粒的构建

3．2 优化的α-木糖苷酶基因表达载体的构建

3．3 α-木糖苷酶基因在大肠杆菌中的表达及纯化

3．4 重组α-木糖苷酶的酶学性质

3．5 酶的动力学参数的测定

4 讨论

第三章 海栖热袍菌来源的木葡聚糖降解酶系的联合作用

1 材料

1．1 菌种与质粒

1．2 培养基

1．3 主要试剂及其来源

1．4 主要设备及其来源

2 方法

2．1 海栖热袍菌α-半乳糖苷酶基因的高效表达及纯化

2．2 海栖热袍菌α-岩藻糖苷酶基因的高效表达及纯化

2．3 海栖热袍菌来源的木葡聚糖酶系对木葡聚糖的协同降解反应

3 结果与分析

3．1 β-半乳糖苷酶基因的克隆及序列分析

3．2 α-岩藻糖苷酶基因的克隆及序列分析

3．3 海栖热袍菌来源的木葡聚糖酶系对木葡聚糖的协同降解反应

5 讨论

第四章 嗜热菌来源的木聚糖酶系联合降解天然半纤维素

1 材料

1．1 菌种和质粒

1．2 培养基

1．3 主要试剂及其来源

1．4 主要设备及其来源

2 方法

2．1 海栖热袍菌来源的葡萄糖醛酸酶基因的克隆及序列分析

2．2 甘蔗渣、玉米芯和蓝莓渣中半纤维素的制备

2．3 耐热性的木聚糖酶系对木聚糖的联合降解反应

3 结果与分析

3．1 α-葡萄糖醛酸酶基因的克隆及序列分析

3．2 耐热性的木聚糖酶系对木聚糖的联合降解反应

讨论

全文总结

参考文献

致谢