2型猪链球菌N-乙酰半乳糖胺和半乳糖胺代谢通路中SSU0448基因功能的初步研究

摘要

猪链球菌(Streptococcus suis，S.suis是一种重要的猪感染致病菌。根据其夹膜抗原的多样性可分为35个血清型。其中2型猪链球菌是致病性最强，临床检出率最高，分布范围最广的一种致病菌。2型猪链球菌（Streptococcus suis serotype2，SS2）作为重要的人兽共患病病原菌，人被该病原菌感染后会患脑膜炎、心内膜炎、败血症、肺炎甚至导致急性死亡。1998年江苏南通和2005年四川资阳地区爆发了大规模的2型猪链球菌感染人事件。值得注意的是，这两次报道的2型猪链球菌感染人事件的临床表现为高侵袭率、深部组织感染以及中毒性休克综合症（streptococcus toxic shock syndrome，STSS）。全世界范围内，2型猪链球菌感染人的事件时有发生，然而其致病机制尚不清楚。
　　通过生物信息学分析预测SSU0448基因是2型猪链球菌强毒株05ZYH33中参与N-乙酰半乳糖胺和半乳糖胺代谢的关键转录调控因子。本研究应用同源重组基因敲除的方法构建和筛选强毒株05ZYH33中SSU0448基因缺失的突变株Δ0448，和功能互补株CΔ0448，系统比较分析突变株Δ0448与野生株05ZYH33、功能互补株CΔ0448的基本生物学特性，以及SSU0448基因的缺失对N-乙酰半乳糖胺和半乳糖胺代谢通路中相关分子的转录改变情况，并通过小鼠毒力实验探索SSU0448基因缺失对2型猪链球菌毒力的影响。实验结果表明，突变株Δ0448对数生长期稍短且较快速到达平台期，在成链能力上较野生株明显减弱，而在菌落形态、革兰染色和溶血活性方面突变株与野生株、并无明显差异;小鼠毒力实验提示SSU0448基因缺失对2型猪链球菌的毒力并无显著改变，但可能延缓致病过程。
　　综上所述，2型猪链球菌中缺失SSU0448基因会导致其生长加快，成链能力降低;在以小鼠为模型的致病实验中，可能延缓2型猪链球菌的致病过程，但不显著改变其对小鼠的侵袭致病能力，我们的研究结果为深入探索2型猪链球菌的致病感染机制提供了依据。

目录

声明

摘要

中英文缩写一览表

第1章 绪论

第2章 SSU0448基因的生物信息学分析及原核表达

2．1 试剂与材料

2．2 实验方法

2．2．1 SSU0448编码基因的一般特性

2．2．2 SSU0448基因及其编码蛋白的三级结构分析

2．2．3 SSU0448基因在大肠杆菌中的表达

2．3 结果

2．3．1 SSU0448编码基因的一般特性

2．3．2 SSU0448编码基因编码蛋白的三级结构分析

2．3．3 SSU0448基因的原核表达

2．4 讨论

第3章 SSU0448基因敲除株与功能互补株的构建与鉴定

3．1 材料和方法

3．1．1 菌株、质粒和引物

3．1．2 试剂和仪器

3．2 SSU0448基因敲除突变株的构建和鉴定

3．2．1 pUC18-Spc的构建

3．2．2 SSU0448基因上游片段L和下游片段R的纯化

3．2．3 pUC18-0448基因敲除质粒的构建

3．3 基因敲除株的构建与筛选

3．3．1 pUC18-0448电转化05ZHY33感受态细胞

3．3．2 突变株的PCR初步筛选

3．3．3 SSU0448基因敲除株的鉴定

3．3．4 突变株△0448的稳定性鉴定

3．3．5 功能互补株的构建

3．3．6 RT-PCR鉴定

3．4 结果

3．4．1 敲除质粒的构建

3．4．2 突变株的筛选与鉴定

3．4．3 功能互补株C△0448的构建和鉴定

3．5 讨论

第4章 SSU0448缺失对SS2强毒株05ZYH33表型的影响

4．1 试剂和材料

4．2 试验方法

4．2．1 敲除株△0448和互补株C△0448稳定性观察

4．2．2 生长速率比较

4．2．3 菌落形态和溶血活性的比较

4．2．4 革兰染色和形态结构的比较

4．2．5 细菌对上皮细胞的的粘附能力及对巨噬细胞的抗吞噬

4．2．6 细菌总RNA的提取及RT-PCR

4．2．7 小鼠致病性实验

4．3 结果

4．3．1 生长稳定性观察

4．3．2 生长速率的比较

4．3．3 菌落形态与溶血活性的的观察

4．3．4 形态结构的比较

4．3．5 对上皮细胞的粘附能力以及对小鼠巨噬细胞的抗吞噬能力

4．3．6 突变株△0448和野生株05ZYH33的基因调节差异

4．3．7 小鼠致病性实验

4．4 讨论

全文总结

参考文献

硕士期间发表的学术论文

致谢