金钗石斛的种质保存、遗传多样性及叶绿体基因组研究

摘要

金钗石斛(Dendrobium nobile Lindl.)为兰科石斛属(Dendrobium)珍稀药用植物，早在《神农本草经》中就有记载，为中国濒危物种，具有滋阴生津、润肺明目、抗癌防老等功效。近年来，由于金钗石斛的大规模开发利用，致使其野生资源遭到毁灭性的破坏，并导致了金钗石斛混淆品的泛滥。因此，务须加强对金钗石斛野生资源种质的研究与保护，并建立有效的金钗石斛种质鉴别的可靠手段。
　　本论文开展了金钗石斛的种质保存工作。发明了一种提高金钗石斛传粉结实率的方法及专用处理剂，申请了专利。专用处理剂为含有Ca(NO3)2、H3BO3、蔗糖、尿素、赤霉素及2，4-D的水溶液。主要流程包括:亲本选取、对传粉时间的选取、人工传粉、套袋处理、金钗石斛种子的收集、无激素的组织培养。上述一种提高金钗石斛传粉结实率的方法及专用处理剂可以明显提高金钗石斛的结实成功率，提高种子产量，而且操作简便，易于掌握，可以在大规模人工育种中推广应用。
　　本论文采用磁珠富集法对金钗石斛微卫星进行了开发。共设计了53对微卫星引物，利用云南、贵州和广西3省4个居群的45个样本，筛选了10对多态性位点丰富的引物。分析表明:这10对微卫星引物具有较高的多态性，平均多态信息含量(PIC)的变化范围从0.55到0.85(PIC＞0.50)，表明10个SSR位点具有足够的信息，可以在金钗石斛居群遗传多样性研究上得到应用。
　　本论文开展了金钗石斛野生居群保护遗传学研究。开发并筛选了9对多态性微卫星引物，对7个金钗石斛居群进行了遗传多样性及遗传结构的研究。运用多种遗传分析软件，推测了自然选择、遗传漂变以及基因流等进化力量在金钗石斛野生居群形成中的作用，阐述了对金钗石斛野生居群种质的保护策略。通过运用筛选出的9个微卫星引物的检测，在102个金钗石斛野生个体中，一共有148个等位基因位点;每个微卫星位点的等位基因数从12～32不等，每个位点的等位基因数的平均值为16.4，表观杂合度(Ho)的范围是从0.503～0.794(平均值为0.695)，期望杂合度(HE)的范围是从0.623～0.909(平均值为0.74)。这9个微卫星位点都表现出了相对较高的PIC值(从0.546～0.860，平均值为0.675)，说明这9个微卫星位点可以用于揭示中国西南部（海南岛，中缅边境，云南省，贵州省，广西省，四川省等地区）金钗石斛野生居群的遗传多样性和遗传分化。结果显示，海南岛与内陆居群分化较大，并且遗传多样性以及遗传变异值较低。必须对海南岛的金钗石斛野生居群开展就地保护，包括生境的修复，以确保海南岛金钗石斛居群的遗传多样性水平并保护其进化潜力;同时开展迁地保护，海南岛居群中的稀有位点个体应当以最高优先级保护，其次是保护具有稀有位点以及最多共同位点的个体，以此确保维持该物种并保持其进化潜力。
　　本论文还开展了叶绿体基因组比较及序列分析，开发了金钗石斛的叶绿体基因组中的微卫星标记(cpSSR)以及叶绿体片段标记用于混淆品种间鉴别。结果显示:金钗石斛与石斛属其他物种的叶绿体基因组的大小相似，且IR区域较为保守，金钗石斛的叶绿体基因组的大小为150，793bp，并且具有四个典型区域，LSC(84，939bp)，SSC(13，310bp)和两个IR(各26，272bp)。本研究从开发的叶绿体片段标记中选取了ycf1(109bp)和trnL-trnF(127bp)序列，通过real-time PCR可以较好的鉴别金钗石斛与石斛属其他物种。基于SYBR GreenⅠ的real-timePCR扩增体系，论文设计了用于鉴定金钗石斛的特异性引物对SDyf/SDyr和SDtf/SDtr，可以特异性地鉴别出金钗石斛及其混伪品，该方法快速、经济，适用于大规模鉴定。

目录

声明

摘要

第1章 文献综述

1．1 药用植物的分子鉴定

1．2 遗传多样性

1．2．1 遗传多样性的概念

1．2．2 影响遗传多样性的因素

1．2．3 遗传多样性的研究方法

1．3 叶绿体基因组的研究进展

1．4 石斛属的遗传学研究进展

1．4．1 石斛属的概况

1．4．2 石斛属种质保护的遗传学研究

1．4．3 石斛属植物种质保护面临的挑战

1．5 金钗石斛的研究现状

1．6 研究的目的与意义

第2章 金钗石斛的种质保存

2．1 材料和方法

2．1．1 材料

2．1．2 方法

2．2 结果和分析

2．2．1 单因素实验结果统计

2．2．2 正交实验结果统计

2．2．3 组织培养

2．3 讨论

2．3．1 各因素水平对金钗石斛结实率的影响

2．3．2 正交实验设计在金钗石斛结实率提高中的应用

2．3．3 种质保存的意义

第3章 金钗石斛野生居群的遗传多样性及遗传结构分析

3．1 引言

3．2 材料与方法

3．2．1 实验材料与保存

3．2．2 微卫星数据的获取及质量控制

3．2．3 遗传多样性分析

3．2．4 居群遗传结构分析

3．2．5 距离隔离格局检验

3．2．6 瓶颈效应及遗传障碍检测

3．3 结果与分析

3．3．1 居群遗传多样性

3．3．2 居群的遗传结构

3．3．3 基因流

3．3．4 瓶颈效应和奠基者效应

3．4 讨论

3．4．1 遗传多样性以及居群结构

3．4．2 最近的统计事件

3．4．3 金钗石斛保护和管理策略

第4章 金钗石斛叶绿体比较基因组学研究

4．1 引言

4．2 材料与方法

4．2．1 材料

4．2．2 DNA的提取和纯化

4．2．3 测序文库的构建、序列的组装

4．2．4 基因标注

4．2．5 金钗石斛叶绿体基因组提交至DDBJ

4．2．6 金钗石斛叶绿体基因组的比较

4．2．7 金钗石斛cpSSR的开发

4．3 结果与分析

4．3．1 金钗石斛的测序结果

4．3．2 金钗石斛的叶绿体基因组结构分析

4．3．3 金钗石斛叶绿体基因组的比较分析

4．3．4 金钗石斛的cpSSR

4．4 讨论

4．4．1 叶绿体比较基因组学在兰科植物中的应用

4．4．2 石斛属比较基因组的应用前景

第5章 基于叶绿体基因组片段和real-time PCR技术鉴别金钗石斛药材

5．1 引言

5．2 材料与方法

5．2．1 样本的采集与保存

5．2．2 方法

5．3 结果和分析

5．3．1 ycfl和trnL-trnF序列

5．3．2 鉴定金钗石斛的特异性位点

5．4 讨论

5．4．1 real-time PCR技术与种质鉴别

5．4．2 叶绿体基因组片段在real-time PCR技术中的应用

第6章 结论与展望

6．1 结论

6．2 展望

参考文献

附录

在读期间发表的学术论文及研究成果

致谢