常见水生动物与其环境DNA的定性与定量关系

摘要

淡水生态系统的生物多样性正面临严重威胁，掌握淡水生态系统生物多样性的变化动态是制定科学的多样性保护对策的前提。传统的以物种为对象的淡水生物多样性的研究方法因耗资巨大、费力费时、物种鉴定人才稀缺等原因，难以满足日益增长的多样性保护需要。本研究以环境DNA为切入点，探索淡水生态系统生物多样性研究的新理论与新方法。主要研究内容包括:1）常见水生动物资料收集整理、DNA barcoding序列筛选、特异引物设计与实验验证以及环境DNA的高效提取与检测;2）室内饲养条件下萼花臂尾轮虫、鲤鱼、泥鳅和日本沼虾等4种常见水生动物的环境DNA定性检测;3）室内饲养条件下泥鳅和日本沼虾饲养密度与环境DNA丰度的定量分析。取得的主要研究成果如下:
　　系统搜集整理了常见水生动物种类的文献资料，搜集汇总了常见水生动物DNA barcoding序列数据，设计出了这些常见水生动物COI基因的特异引物，并通过了特异性的实验验证。比较了真空浓缩仪浓缩、PEG2000浓缩、旋转蒸发仪浓缩、冷冻干燥机浓缩、酒精多次沉淀法浓缩5种水样浓缩方法，发现酒精多次沉淀法浓缩的水样可获得最佳的环境DNA的提取效果。
　　开展了萼花臂尾轮虫(Brachionus calyciflorus Pallas)、鲤鱼（Cyprinus carpio）、泥鳅（Misgurnus anguillicaudatus）和日本沼虾（Macrobrachium nipponense）等4种常见水生动物的室内饲养试验并对它们的环境DNA进行了定性检测:利用醇沉法提取从饲养箱中抽取的水样里的环境DNA，以4种常见水生动物的环境DNA模板、利用4种常见水生动物的特异性引物进行普通PCR扩增和PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示，4种常见水生动物的环境DNA均能够扩增出特异目的片段。这表明，通过对环境DNA的检测确实可以实现对水体中生活的水生动物的定性检测。
　　进行了泥鳅和日本沼虾2种常见水生动物的饲养密度与环境DNA丰度的定量分析:利用荧光定量PCR的方法对不同饲养密度的水样中的环境DNA进行环境DNA的定量分析。结果，无论是泥鳅还是日本沼虾，它们环境DNA的量均随饲养密度的增加而增加，两个物种的饲养密度与其环境DNA之间的模拟曲线均为二项式曲线，显示动物密度与其环境DNA之间存在非线性的相关关系。
　　综上可见，环境DNA与相应水生动物之间确实存在着密切的内在联系，通过对水体中环境DNA的定性、定量检测可以实现对水体中生活的水生动物种类与丰富度的检测。

目录

声明

摘要

第1章 绪论

1．1 淡水生态系统的生物多样性

1．1．1 淡水生物多样性的现状

1．1．2 淡水生物多样性的研究方法

1．2 环境DNA研究现状

1．2．1 环境DNA的定性检测研究进展

1．2．2 环境DNA的定量检测研究进展

1．2．3 环境DNA的应用领域

1．2．4 环境DNA的研究前景及问题

1．3 淡水生物的定性检测方法

1．3．1 SNA条形码技术

1．3．2 DNA barcoding方法与传统方法优劣势比较

1．4 所选四种目标物种的生活习性特点

1．5 本研究的目的和意义

第2章 环境DNA检测方法研究

2．1 材料与方法

2．1．1 常见水生动物搜索

2．1．2 查找常见水生动物barcoding序列

2．1．3 特异性引物设计与检测

2．1．4 样品浓缩方法和DNA提取试剂盒确定

2．1．5 琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物

2．2 实验结果与分析

2．2．1 常见水生动物搜索结果

2．2．2 DNA barcoding库搜索结果

2．2．3 设计特异性引物序列

2．2．4 特异性引物琼脂糖凝胶电泳检测图

2．2．5 五种浓缩方法探索结果

2．4 讨论

第3章 基于环境DNA的四种常见淡水动物的定性检测

3．1 材料、仪器与试剂

3．1．1 实验材料

3．1．2 实验仪器和试剂

3．2 实验方法

3．2．1 目标物种barcoding序列

3．2．2 设计特异性引物

3．2．3 样品浓缩

3．2．4 实验物种的培养条件

3．2．5 根据浓缩方法-乙醇沉淀法进行环境DNA的提取

3．2．6 琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物

3．3 实验结果与分析

3．3．1 DNA barcoding库搜索结果

3．3．2 设计特异性引物序列

3．3．3 PCR扩增条件

3．3．4 扩增产物的琼脂糖凝胶电泳

3．3．5 各物种PCR后琼脂糖凝胶检测图

3．3．6 不同密度梯度下各物种的PCR检测率

3．4 讨论

第4章 泥鳅和日本沼虾与其环境DNA之间的数量关系

4．1 材料、仪器与试剂

4．1．1 实验材料

4．1．2 实验仪器和试剂

4．2 实验方法

4．2．1 环境DNA的提取

4．2．2 环境DNA浓度检测

4．2．3 PCR以及琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物

4．2．4 实时荧光定量PCR

4．3 实验结果与分析

4．3．1 环境DNA浓度检测

4．3．2 PCR产物检测率

4．3．3 测序结果

4．3．4 基因的荧光定量PCR扩增产物特异性

4．3．5 基因的荧光定量PCR分析

4．4 讨论

第5章 全文总结

参考文献

在读期间发表的学术论文及研究成果

致谢